新生儿脓毒血症血清miR-141、miR-181a水平及对病情严重程度的影响

刘延霞,麦菁芸,林则彬,蒙晶

新生儿脓毒血症是指细菌、真菌等微生物在新生儿血液中异常增殖并分泌毒素产生全身炎性反应的一种综合征[1]。临床多表现为感染性休克和多器官功能障碍,严重者会迅速死亡[2]。研究表明,新生儿脓毒血症的病死率可高达50%[3]。因此,需要找到能预测脓毒血症病情严重程度的指标,从而早期干预,防止病情恶化。研究表明,C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)和降钙素原(procalcitonin,PCT)等炎性指标对脓毒血症有较好的诊断价值,但对病情变化的预测不理想[4]。近年来研究发现,miR-141、miR-181a广泛参与炎性反应,对胃炎、类风湿关节炎等疾病有较好的预测价值[5-6],但目前尚无二者与脓毒血症严重程度有关的报道。现分析血清miR-141、miR-181a水平对新生儿脓毒血症病情严重程度的影响,建立新的预测指标体系,及时判断脓毒血症病情变化,从而尽早优化治疗方案,防止病情恶化,报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2021年6月—2022年8月海南现代妇女儿童医院新生儿科收治脓毒血症患儿50例为研究对象。根据患儿的序贯器官衰竭评分(sequential organ failure assessment, SOFA)分为轻症组27例和重症组23例。2组患儿在性别、胎龄、出生体质量、发病日龄、感染部位比较,差异均无统计学意义(P>0.05),具有可比性,见表1。本研究经医院伦理委员会批准(HL2021013),患儿家属知情同意并签署知情同意书。

1.2 病例选择标准 (1) 诊断标准:参照“中国脓毒症/脓毒性休克急诊治疗指南(2018)”[7]制定:①白细胞水平异常(所有白细胞或中性粒细胞水平变化>10%);②直肠、膀胱、口腔或中心静脉导管测量体温异常(>38.5℃或<36℃);③心率>同年龄组2个标准差,持续加快超过30 min且无明确病因,或心率<同年龄组第10百分位,持续减慢超过30 min且无明确病因;④呼吸频率>同年龄组2个标准差,或需要机械通气。以上4项需包含2项以上,且必须包含①或②项。(2)纳入标准:①符合新生儿脓毒血症诊断;②发病48 h内;③之前未接受药物或其他措施治疗 。(3)排除标准:①合并先天性心脏病;②合并血液系统疾病;③合并先天性畸形;④合并新生儿黄疸;⑤合并肝肾功能不全;⑥临床资料不完整。

表1 轻症组、重症组患儿临床资料比较

1.3 观测指标与方法

1.3.1 血清miR-141和miR-181a表达检测: 抽取患儿空腹静脉血3 ml,离心留取上层血清。采用miRNA提取分离试剂盒[凯杰生物工程(深圳)有限公司]提取血清miRNA,采用miRNA的cDNA反转录试剂盒(北京百奥莱博科技有限公司)将miRNA反转录为cDNA。根据miRNA荧光定量检测试剂盒(上海泽叶生物科技有限公司)说明书配制反转录体系,将配置好的体系放入Aplied Biosystems的实时荧光定量PCR仪进行扩增。反应程序为:95℃加热1 min,95℃变性30 s、58℃退火40 s、72℃延伸30 s,最后72℃加热5 min充分反应,共进行40个循环。miR-141和miR-181a的引物由上海生物工程公司合成,miR-141上游引物:5’-GTACCCTCTAGAAGTCGCGCCA-3’,下游引物:5’-AGTCACTACTGAAGATCTG-3’; miR-181a上游引物:5’-CTCGGCTCTGGCAGTCTATCT-3’,下游引物:5’-TCGTTCTCGACCTGCCGGAT-3’;内参采用U6基因,上游引物:5’-GACTGATGCTCTGGCCGA-3’,下游引物:5’-GTCGGGTCGAAGCATGG-3’。采用2-△△Ct法计算miR-141和miR-181a的表达量。

1.3.2 血清CRP和PCT水平检测:上述血清采用酶联免疫试剂盒进行检测(北京普利莱基因技术有限公司)。准备酶标板,每孔分别滴加血清和标准品25 μl,37℃孵育15 min,再滴加酶底物100 μl,反应20 min,加入显色液,避光15 min,最后滴加终止液。将酶标板放入酶标仪(山东云唐科技有限公司,型号:YT-MB96A)中,于450 nm波长处检测溶液吸光度,计算CRP、PCT水平。

1.3.3 急性生理与慢性健康评分:急性生理与慢性健康评分(acute physiology and chronic health evaluation-Ⅱ,APACHE-Ⅱ)测量包含3部分:(1)生理状态评分:体温、脉搏、呼吸、血压、血细胞分析、肝肾功能、血气分析、格拉斯哥评分等12个项目;(2)年龄评分:为0～6分;(3)慢性病状态评分:择期手术2分,其余情况5分。将以上三项分数相加,即为总评分。分数越高,患者预后越差,死亡风险越大。

2 结 果

2.1 2组血清miR-141、miR-181a、 CRP、PCT水平比较 重症组血清miR-141和miR-181a水平低于轻症组, CRP、PCT水平高于轻症组,差异均有统计学意义(P均<0.01),见表2。

表2 轻症组与重症组患者血清miR-141、miR-181a、 CRP、PCT水平比较

2.2 2组APACHE-Ⅱ评分比较 重症组APACHE-Ⅱ评分为(32.58±6.47)分,高于轻症组的(21.72±4.35)分(t/P=7.054/<0.001)。

2.3 血清miR-141、miR-181a与APACHE-Ⅱ评分、CRP、PCT的相关性 脓毒血症患儿血清miR-141、miR-181a均与APACHE-Ⅱ评分、CRP、PCT呈明显负相关(P均<0.01),见表3。

表3 脓毒血症患儿血清miR-141、miR-181a与APACHE-Ⅱ评分、CRP、PCT的相关性

2.4 脓毒血症患儿病情加重的多因素Logistic回归分析 以新生儿脓毒血症病情严重程度为因变量,以上述结果中P<0.05项目为自变量进行多因素Logistic回归分析,结果显示,血清miR-141高和miR-181a高为脓毒血症患儿病情加重的保护因素(P均<0.01),APACHE-Ⅱ评分高、CRP高和PCT高为病情加重的危险因素(P均<0.01),见表4。

表4 脓毒血症患儿病情加重的多因素Logistic回归分析

2.5 血清miR-141、miR-181a对脓毒血症患儿病情变化的ROC曲线分析 绘制血清miR-141、miR-181a水平预测新生儿脓毒血症病情严重程度的效能ROC曲线,并计算曲线下面积(AUC),结果显示,血清miR-141、miR-181a及二者联合预测新生儿脓毒血症病情严重程度的AUC分别为0.936、0.856、0.959 ,二者联合检测优于各自单独预测效能(Z=5.318、9.652,P<0.001),见表5、图1。

3 讨 论

脓毒血症是新生儿常见的死亡原因,发病率逐年增长[8]。肺部、胃肠道等是脓毒血症最常发生的部位,临床表现为重症肺炎、急性肺损伤、肠道功能紊乱,甚至多器官功能障碍,导致死亡[9]。发病机制包括感染引起的血管内皮受损、炎性因子升高、代谢功能异常等,其中炎性因子与感染后病情加重存在密切关联[10]。机体产生的内毒素会诱导caspase活化,增强鞘氨醇-磷酸2受体信号,导致其对炎性小体敏感性增加,激活细胞凋亡途径,从而导致临近组织细胞发生炎性反应,产生细胞损伤,导致脓毒症发生,当炎性反应长时间持续时,会严重抑制免疫功能,引起脓毒症休克,甚至死亡[11]。因此,寻找到能准确预测脓毒血症预后的指标很关键。

表5 血清miR-141、miR-181a预测脓毒血症患儿病情变化的价值比较

图1 血清miR-141、miR-181a及二者联合预测脓毒血症患儿病情程度的ROC曲线

CRP是产自肝细胞中的一种急性期蛋白,与非特异性免疫有关,其水平能指示炎性反应程度,然而其在早期升高不明显,通常在严重感染后18 h才显著上升,在炎性反应消退后1～3 d才恢复至正常水平,因此其对于预测炎性疾病的预后价值有限[12]。PCT在正常人体内水平较低,当出现脓毒血症时,血清水平迅速增加,在感染早期即可有明显上升,然而其峰值持续时间过长,不能及时随机体感染好转而下降,因此对于疾病的预后预测价值不理想[13]。APACHE-Ⅱ评分广泛应用于脓毒血症等严重感染性疾病的评估,但是其主观性较强,存在评价者个体差异问题,因此预后价值不高[14]。近年来发现,许多miRNA均参与炎性反应,其表达水平与感染的严重程度和预后有关,其中miR-141和miR-181a在肺炎、类风湿关节炎等炎性疾病的严重程度预测方面都有很好的价值,但是对新生儿脓毒血症病情变化的影响尚无报道[15-16]。因此,本研究分析了新生儿脓毒血症血清miR-141和miR-181a表达水平,比较了二者与以往研究指标APACHE-Ⅱ评分、CRP和PCT的作用大小,从而有力证明了血清miR-141和miR-181a对病情变化的预测价值。

miR-141是miR-200家族(miR-141、miR-200a、miR-200b、miR-200c及miR-429)成员之一,是一个成熟的序列,全长共22 个核苷酸[17]。miR-141可以通过结合不同靶点经多条通路调节一系列的生理过程,可在细胞生长和凋亡、新陈代谢、炎性反应、血管新生等多个生物学过程中发挥重要的调控作用[18]。本研究结果提示,miR-141对于新生儿脓毒血症具有很好的预后预测价值。李静等[19]发现,miR-141水平升高,能抑制脂多糖诱导的肺上皮细胞中IL-6和IL-1β的表达,从而减轻上皮细胞损伤。臧雪风等[20]测量了167例高血压性脑出血患者血清miR-141水平,发现其与TNF-α、IL-1β、IL-6水平均呈负相关,miR-141是高血压脑出血的预后保护因素,这与本研究结果一致。陈胜乐等[21]研究表明,miR-141抑制炎性反应的机制可能是通过抑制NF-κB信号通路,阻断IκB激酶α、磷酸化IκB激酶α等因子的信号转导,从而降低IL-1、IL-10、TNF-α等炎性因子水平,从而促进炎性细胞凋亡,缓解炎性反应。然而,也有少数研究认为miR-141与炎性反应可能存在相互促进的关系,陈筱涛等[22]采集108例尿毒症患者外周血,发现miR-141高表达与微炎性状态有关,与本研究结果存在争议,原因可能是由于尿毒症患者存在严重肾功能损害,引起血清miR-141异常升高所致。

miR-181a作为一种重要的miRNA,其包含2条前体序列:其中1条前体序列位于1号染色体反义链,另1条位于9号染色体正义链,2条序列经转录后再进一步加工为成熟序列,长度为23 nt,参与调控靶基因表达[23]。作为miR-181家族成员,miR-181a种子区域高度保守,其不仅参与细胞的分化发育,还在介导肿瘤发生、侵袭转移及炎性反应等方面发挥重要作用[24]。本研究结果提示,miR-181a对于新生儿脓毒血症具有较好的预后价值。杨晓娜等[25]发现,慢性阻塞性肺疾病患者血清miR-181a低于健康对照组,miR-181a水平与IL-1β、hs-CRP等炎性因子呈负相关。李强等[26]检测了50例冠心病患者和50例健康人的miR-181a水平,发现miR-181a在冠心病患者中低表达,以上研究与本研究结果一致。陶凤姣等[27]研究表明,miR-181a可能是通过抑制TLR4/MyD88信号通路,减轻嗜酸性粒细胞等炎性细胞浸润,从而减轻炎性反应。但是也有少数研究结果存在争议,古裕鸟等[28]发现新生儿呼吸窘迫综合征血清miR-181a升高与病情严重程度呈正相关,这与本研究结果不一致,原因可能是该研究各组间样本量不均衡(非危重组53例、危重组24例、极危重组15例),可能会导致组间测量结果不稳定,同时单组样本量过少(极危重组15例)会降低统计效能。

本研究的优点在于通过相关分析表明了miR-141、miR-181a与多种炎性因子的相关性强度,采用多因素Logistic回归分析得出miR-141、miR-181a对病情严重程度的预测作用大小,通过ROC曲线得出了miR-141、miR-181a的预测准确率,通过多个定量结果证明了二者对病情的预测价值。本研究不足之处在于仅研究了患儿病情轻重这一个因素,在以后的研究中,可以考虑对患儿进行长期随访,采用生存分析研究miR-141、miR-181a的远期预后价值。

综上所述,血清miR-141和miR-181a在新生儿脓毒血症中低表达,与APACHE-Ⅱ评分、CRP和PCT呈负相关,其水平升高是脓毒血症患儿病情严重程度的保护因素,对新生儿脓毒血症病情变化有很好的预测价值。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

刘延霞:设计研究方案,论文撰写;麦菁芸:分析试验数据,论文修改;林则彬:实施研究过程,资料搜集整理;蒙晶:提出研究思路,论文审核