膀胱癌组织miR-20a-5p、NR4A3表达及其与患者临床病理特征、预后的关系

杨海北,王卫生,桂俊卿,徐跃文,崔茂荣,张超,刘志明

膀胱癌(bladder cancer,BC)发病率和病死率较高,是全球最常见的泌尿生殖系统恶性肿瘤之一,分为非肌层浸润性(NMIBC,75%,T1)和肌肉浸润性膀胱癌(MIBC,25%,T2～T4)[1-2]。BC易转移、易复发、早期无明显症状的特点使其在临床中诊断困难,导致BC患者的诊断、治疗被延误,生存率和预后较差[3-5]。因此,寻求与BC相关的生物标志物对其早期诊断和预后十分重要。MicroRNA(miRs)的异常表达与肿瘤的增殖、分化、侵袭、迁移等生物学进展有关,据报道,miR-20a-5p在肿瘤发生中起复杂作用[6-7]。此外,核受体亚家族4成员3(NR4A3)的下调也被发现与髓系白血病中分化状态受损有关[8]。miR-20a-5p、NR4A3在BC中表达及与预后的关系未见报道。因此,本试验对其进行研究,报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2016年12月—2019年1月曲靖市第一人民医院泌尿外科行手术治疗BC患者30例,收集其膀胱癌组织及相应的癌旁组织,其中男11例,女19例,年龄35～68(52.44±7.94)岁,组织病理学分级按WHO标准:Ⅰ～Ⅱ级10例,Ⅲ级20例;临床分期基于UICC-TNM标准[9]:Ⅰ～Ⅱ期13例,Ⅲ～Ⅳ期17例。本研究已经获得医院伦理委员会批准(2016-1109003),患者及家属知情同意并签署知情同意书。

1.2 病例选择标准 (1)纳入标准:①术后病理诊断为BC[10];②患者无化疗及其他治疗史;③患者的临床病理资料完整。(2)排除标准:①患其他免疫系统或其他恶性肿瘤者;②有肝肾功能障碍及尿石症、腺性膀胱炎反复发作者;③有严重心脏疾病及认知功能损伤者;④患有感染性疾病者。BC的病理类型由2位经验丰富的病理学医生独立诊断。

1.3 观测指标与方法

1.3.1 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测miR-20a-5p、NR4A3表达:使用NanoDrop 1000(Thermo Scientific,USA)从处于冻存状态病变组织(手术时收集)中提取总RNA,并进行逆转录。计算A260/A280比率以评估RNA质量和纯度。在推荐的热循环设置下,使用ABI 7300(ABI,Foster City,CA,USA)进行qRT-PCR分析,步骤如下:95℃初始循环30 s,然后95℃ 30 s 、58℃ 30 s 、72℃ 30 s ,共40个循环。分别以U6、β-actin为内参。基因相关序列见表1。反应结束后miR-20a-5p、NR4A3 mRNA的相对表达量采用2-ΔΔCt法计算。

表1 基因引物序列

1.3.2 随访情况:随访起点为手术开始时,终点为2022年1月,进行为期3年的术后随访。术后通过电话访问、门诊复查等方式对所有患者进行随访,全部病例无失访,记录患者生存情况。

2 结 果

2.1 miR-20a-5p、NR4A3在BC癌组织和癌旁组织中表达比较 与癌旁组织比较,BC癌组织的miR-20a-5p水平上升,NR4A3水平下降(P<0.01),见表2。

表2 miR-20a-5p、NR4A3在BC癌组织和癌旁组织表达比较

2.2 BC癌组织中miR-20a-5p与NR4A3 mRNA表达的相关性 Pearson相关性分析显示,BC癌组织中miR-20a-5p与NR4A3表达呈负相关(r=-0.599,P<0.001)

2.3 miR-20a-5p、NR4A3表达在BC患者不同临床病理参数中比较 病理Ⅲ级、TNM Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴结转移BC患者miR-20a-5p表达高于病理Ⅰ～Ⅱ级、TNM Ⅰ～Ⅱ期、无淋巴结转移者(P<0.05);病理Ⅲ级、TNM Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴结转移者NR4A3表达低于病理Ⅰ～Ⅱ级、TNM Ⅰ～Ⅱ期、无淋巴结转移者高于,差异均有统计学意义(P<0.01);BC患者miR-20a-5p、NR4A3表达在性别、年龄、吸烟史、肌层浸润、肿瘤大小、肿瘤数量等方面比较,差异均无统计学意义(P>0.05),见表3。

2.4 miR-20a-5p、NR4A3表达与BC患者预后的关系 经过3年随访,30例BC患者死亡11例,生存19例,总生存率为63.33%。miR-20a-5p高表达者3年生存率为47.06%(8/17),低于低表达者的84.62%(11/13),差异有统计学意义(χ2=4.474,P=0.034);NR4A3低表达者3年生存率为37.50%(6/16),低于高表达者的92.86%(13/14),差异有统计学意义(χ2=9.853,P=0.002),见图1。

2.5 BC患者预后影响因素的Cox回归分析 以BC患者预后为因变量,以病理分级(Ⅰ～Ⅱ级=0,Ⅲ级=1)、TNM分期(Ⅰ～Ⅱ期=0,Ⅲ～Ⅳ期=1)、淋巴结转移(无=0,有=1)、miR-20a-5p(具体值)、NR4A3(具体值)为自变量,进行多因素Cox回归分析,结果显示,miR-20a-5p高表达是影响膀胱癌患者预后的独立危险因素(P<0.01),见表4。

3 讨 论

BC是泌尿生殖系统常见恶性肿瘤之一,它在我国的发病率和病死率非常高,其患病率在发达国家甚至全世界都在上升[11-12]。2020年美国估计有81 400例新发病例和17 980例BC患者死亡,BC通过膀胱壁浸润深度的测量可分为NMIBC和MIBC[13]。目前BC的诊断和监测的标准方法为膀胱镜检查,但膀胱镜检查的敏感度较低,不但易引起排尿困难和尿路感染等并发症,还会造成漏诊的情况[14]。此外,BC的异质性和易复发的特点也给BC的临床诊断增加了困难,导致预后较差[10]。因此,寻找与BC关系密切的生物标志物对其早诊断、早治疗,以期提高BC患者生存率和改善预后情况。

表3 miR-20a-5p、NR4A3表达在BC患者不同临床病理参数中比较

图1 BC癌组织miR-20a-5p、NR4A3表达与患者3年总生存率的关系

表4 影响BC患者预后的多因素Cox回归分析

miRNA是小的、非编码的单链RNA分子,长度约为22个核苷酸,它们与靶基因的3′-非翻译区(3′ UTR)互补结合,导致mRNA降解或抑制翻译,而miRNA失调与肿瘤生长、耐药性和转移有关,使其成为不同癌症的潜在诊断和预后生物标志物[15]。miR-17-92簇位于13号染色体上MIR17HG(C13orf25)的内含子中,包括6个成员:miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-19b、miR-20a和miR-92a,参与调节细胞增殖、细胞周期进程和细胞凋亡[15]。既往研究发现,miR-20a-5p是一种致癌基因,在前列腺癌、甲状腺癌中,其高表达促进了肿瘤细胞的增殖和迁移[16-17]。本试验结果进一步验证了上述结论,即miR-20a-5p高表达对肿瘤细胞的侵袭和迁移有促进作用,从而进一步促进BC的发展。这也与既往实验中外源性miR-20a-5p过表达促进BC细胞的增殖、迁移和侵袭的结果一致[10]。此外,miR-20a-5p高表达患者生存率显著低于低表达患者,进一步通过Cox回归分析发现,miR-20a-5p高表达是BC预后的独立危险因素,在Stoen等[16]在前列腺癌的实验中也发现类似结果。提示miR-20a-5p未来可能作为BC预后生物标志物。

NR4A3也称为神经元衍生的孤儿受体1(NOR1),是孤儿核受体家族的成员,NR4A3是一种新的肿瘤抑制基因,其表达在肿瘤中下调,NR4A3的上调表达可以抑制癌细胞侵袭和转移[18]。Son等[19]发现在激素疗法联合放疗后,A549肺癌细胞中NR4A3水平升高,NR4A3可通过提高细胞内活性氧水平诱导细胞凋亡并抑制细胞增殖。Lin等[20]研究也表明,NR4A3维持MT-2信号传导以抑制前列腺癌细胞侵袭、肿瘤生长和转移,并通过促进p21和PAI-1表达作为TGF-β/Smad2信号通路抑制肿瘤。这与本试验中NR4A3在BC肿瘤组织中的降低趋势及抑制肿瘤细胞侵袭和迁移的结果一致。此外,Fan等[21]也发现,NR4A3在BC中表达下调,对BC细胞增殖和干性有抑制作用,进一步验证了本研究结果。本试验进一步研究发现,miR-20a-5p是NR4A3的靶基因,二者呈负调控关系。这与Zhao等[22]认为miR-20a可通过靶向NR4A3促进DRG神经元的轴突再生,以及Yang等[10]在BC实验中表明,miR-20a-5p可以靶向NR4A3,即miR-20a-5p通过抑制抑瘤基因NR4A3的表达促进BC细胞的生长和转移结果一致。以上结果显示,miR-20a-5p通过负靶向NR4A3来参与BC疾病的发生、发展。但miR-20a-5p、NR4A3表达水平在BC中的发病机制尚不明确,本研究仅分析了BC患者癌组织中miR-20a-5p、NR4A3表达水平与其临床病理特征和预后的关系,其具体机制还需进一步研究。

综上所述,BC癌组织中miR-20a-5p表达水平升高,NR4A3表达水平降低,与BC病理分级、TNM分期、淋巴结转移及预后有关,其中miR-20a-5p为BC预后的独立危险因素,且miR-20a-5p通过负靶向调控NR4A3参与BC疾病的发生、发展。然而本研究仅将BC组织作为研究样本,未能选取血清等其他样本检测验证,且样本量较小,试验结果存在局限性,后期可进一步使用大样本血清对其具体机制进行研究,对临床中BC的诊疗提供基础依据。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

杨海北、王卫生:设计研究方案,实施研究过程,论文撰写;桂俊卿、徐跃文:进行统计学分析;崔茂荣、张超:实施研究过程,资料搜集整理,论文修改;刘志明:提出研究思路,分析试验数据,论文审核