三阴性乳腺癌组织中NRP-1和PD-L1表达及临床意义

马啸,刘浩楠,吕帝,崔永征,韩正祥

在世界范围内,乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤[1],是女性健康的主要威胁之一。其中三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer,TNBC)是指乳腺癌组织中免疫组化结果为雌激素受体(estrogen receptor,ER)、孕激素受体(progesterone receptor,PR)、人类表皮生长因子受体-2(human epidermal growth factor receptor 2,HER-2)均为阴性的特殊类型乳腺癌[2]。TNBC约占所有乳腺癌病理类型的15%～20%[3]。传统的内分泌治疗及抗HER-2治疗均无效且其具有侵袭性强、复发性高等生物学特性[4-5],因此预后极差,寻找有效的治疗手段迫在眉睫。

近年来随着免疫治疗不断发展,免疫检查点抑制剂药物在许多晚期恶性肿瘤中的广泛应用为TNBC的治疗带来了曙光[6]。神经纤毛蛋白-1(neuropilin-1,NRP-1)是一种非酪氨酸激酶跨膜糖蛋白受体,同时也是血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的共受体,在神经发育、血管生成、肿瘤的增殖和转移中发挥重要作用[7]。研究发现,NRP-1在淋巴瘤、卵巢癌、黑色素瘤、胃肠道肿瘤等多种人类肿瘤组织中均过表达,但在相应的正常组织中表达较低,并与肿瘤的预后相关[8-10]。在TNBC中尚无关于NRP-1、PD-L1表达水平的相关性研究。因此本研究通过检测TNBC组织标本中NRP-1和PD-L1的表达水平,分析其相关性及与预后的关系,以为TNBC的诊断、个体化治疗、预后评估等提供新策略,报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2012年3月—2014年12月行手术治疗的TNBC患者40例的癌组织及10例对应的癌旁组织(组织芯片均购自上海芯超生物科技有限公司),患者均为女性,中位年龄53(28～84)岁。患者术前均未行放、化疗或其他针对肿瘤的治疗。依据世界卫生组织(WHO)乳腺肿瘤分类标准进行分类分级:G2级22例,G3级18例;TNM临床分期:0期4例,Ⅰ～Ⅱ期25例,Ⅲ～Ⅳ期11例。本研究于2019年10月11日通过上海芯超生物科技有限公司伦理委员会的批准(YB M-05-02),患者及家属知情同意并签署知情同意书。

1.2 NRP-1和PD-L1表达检测 采用免疫组化方法检测,将组织芯片放入烘箱中,烘蜡1 h,脱蜡。将玻片进行修复,而后放在室温的蒸馏水中,使其自然冷却>10 min,PBS缓冲液冲洗;加入稀释好的一抗工作液,4℃度冰箱过夜。冰箱取出玻片,室温复温45 min,PBS缓冲液清洗玻片;玻片放入DAKO全自动免疫组化仪,按照“Autostainer Link 48使用指南”选择相应程序运行阻断、二抗结合、DAB显色程序;苏木素染色1 min,在0.25%的盐酸酒精(70%酒精400 ml+浓盐酸1 ml)中浸没约10 s,自来水冲洗5 min;室温晾干玻片,中性树脂封片;免疫组化染色均采用EnVision法,NRP-1抗体(鼠单克隆抗体,稀释比1∶1 000)和PD-L1抗体(鼠单克隆抗体,稀释比1∶1 000)购自南京肽迪生物技术中心。具体操作步骤严格按试剂盒说明书进行。

1.3 结果判断 NRP-1蛋白主要表达于细胞浆,PD-L1主要表达于细胞膜和细胞浆。以细胞相应部位呈棕色或棕黄色判定为阳性染色,根据细胞染色强度进行评分,分别记为0分(阴性),0.5分(±),1分(+),2分(++),3分(+++);根据阳性细胞占肿瘤细胞总数的百分比,将染色阳性率评分记为0～100%。免疫组化总评分为“染色强度评分”与“染色阳性率”的乘积,分值范围为0～300%。胞浆NRP-1:总评分≤160%为低表达,>160%为高表达;胞浆 PD-L1:总评分≤15%为低表达,>15%为高表达。

2 结 果

2.1 TNBC癌组织及癌旁组织NRP-1和PD-L1表达比较 TNBC中PD-L1阳性定位于细胞膜和细胞浆上,NRP-1定位于细胞浆,见图1。PD-L1在TNBC癌组织和癌旁组织的阳性率分别为80%和20%;NRP-1在TNBC癌组织和癌旁组织的阳性率分别为80%和20%。NRP-1蛋白、PD-L1蛋白在癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织(P<0.01),见表1、图2。

2.2 TNBC癌组织NRP-1与PD-L1表达的相关性 根据Spearman检验可知, NRP-1与PD-L1的表达呈正相关(r=0.570,P<0.001) 。GEPIA 数据库(http://gepia. cancer-pku.cn/)分析显示,NRP-1与PD-L1表达呈正相关(r=0.065,P=0.016),与上述结果一致。

2.3 NRP-1和PD-L1的表达与临床/病理特征的相关性 NRP-1的表达与病理分级、肿瘤直径明显相关(P<0.05);PD-L1的表达与病理分级、Ki67水平明显相关(P<0.05),见表2。

2.4 NRP-1和PD-L1表达与患者预后关系分析 Kaplan-Meier生存曲线显示,PD-L1高表达患者的中位OS短于PD-L1低表达患者(13.1个月 vs. 15.1个月,χ2=9.641,P=0.001);NRP-1高表达患者中位OS短于低表达患者(13.6个月 vs. 15.2个月,χ2=14.510,P=0.002);PD-L1和NRP-1均高表达患者中位OS显著短于PD-L1和NRP-1均低表达患者(13.5个月 vs. 15.2个月,χ2=15.940,P=0.001)。

表1 PD-L1和NRP-1在三阴性乳腺癌组织和癌旁组织表达比较 [例(%)]

2.5 TNBC患者预后影响因素的Cox回归模型分析 以TNBC患者预后为因变量,上述结果P<0.05因素为自变量进行Cox回归模型分析,结果显示,PD-L1表达水平高是影响患者预后的独立危险因素(P=0.021),而年龄、病理分级、肿瘤直径、TNM分期、Ki67水平和NRP-1表达水平不是影响患者预后的独立危险因素(P>0.05),见表3。Kaplan-Meier Plotter数据库(https: //kmplot.com/analysis/)分析结果也显示,NRP-1高表达患者较低表达患者风险比例高60%(图3A),PD-L1高表达患者较低表达患者风险比例高36%(图3B)。

注:A.PD-L1高表达;B.PD-L1低表达;C.NRP-1高表达;D.NRP-1低表达

表2 NRP-1和PD-L1的表达与临床/病理特征的相关性 [例(%)]

表3 三阴性乳腺癌患者预后影响因素的Cox回归模型分析

3 讨 论

由于生活压力的增加、生育模式及生活环境的改变,乳腺癌发病率逐年升高,并呈现出年轻化的趋势[11]。随着精准医学的不断发展,尽管内分泌治疗、化学治疗、放射治疗、靶向治疗及免疫治疗提高了乳腺癌患者的生存率[12],但TNBC由于自身生物学特性,治疗方式有限且预后差,因此目前迫切需要能够找到在TNBC中表达且与肿瘤进展和预后有关的分子,为TNBC患者提供更有效、更特异的治疗方案。

PD-L1是一种Ⅰ型跨膜蛋白,属于B7共刺激分子家族,可称为CD274[13]。它在多种肿瘤细胞表面表达,在体内与肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte, TIL)上的PD-1进行结合,传导免疫抑制的信号,抑制TIL的增生和活化,并阻止抗原特异性CD8+

图3 Kaplan-Meier Plotter 在线数据库中NRP-1和PD-L1的表达与患者预后关系

T淋巴细胞消除肿瘤细胞,从而使TIL处于失活的状态,最终诱导免疫逃逸[14]。黄淅睿等[15]报道PD-L1在TNBC患者中过表达,其机制尚不清楚,但它被认为与更强的侵袭力和较差的预后有关。一些针对PD-L1的单克隆抗体,能够竞争性地与人体内的PD-L1结合,从而影响到PD-1和PD-L1的结合,故而能够解除PD-1和PD-L1结合所介导的免疫功能抑制,使人体内CD8+T细胞被重新激活[16]。在肿瘤微环境(tumor microenvironment, TME)中会有活化的T细胞大量聚集,从而启动人体的抗肿瘤免疫反应[17]。

NRP-1是一类非酪氨酸激酶跨膜多功能糖蛋白,它可以与血管内皮生长因子受体2(vascular endothelial cell growth factor receptor 2,VEGFR2)一起作为VEGF的共受体,通过增强VEGF165(vascular endothelial cell growth factor 165)与VEGFR2结合,增加血管内皮的趋化性、诱导内皮细胞的迁移,促进肿瘤血管的生成[18-19]。在TME中,可通过调节性T细胞(Tregs)上表达的NRP-1起作用,肿瘤衍生的VEGF吸引NRP-1+Treg向肿瘤组织募集[20],增强肿瘤的免疫逃逸;Tregs还可通过与NRP-1的相互作用,弱化树突状细胞(DC)活化效应性T细胞的功能,最终使效应性T淋巴细胞活化不足。胸腺来源的Tregs可表达PD-1,PD-1/PD-L1相互作用有助于使CD4+T细胞转化成Treg细胞,Treg细胞上表达的PD-1还可以与T细胞上表达的PD-L1相互作用,以介导免疫抑制,在抗原识别过程中,NRP-1表达促进Treg与DC的相互作用,从而抑制T细胞活化[21-22]。但NRP-1与PD-L1相互作用的机制仍不明确。

本研究发现,在TNBC癌组织中PD-L1和NRP-1的表达水平高于癌旁组织,且二者表达存在正相关性。进一步探讨发现PD-L1和NRP-1均高表达的患者预后较差,基于这一结果,对于临床中出现双基因高表达患者可以进行早期发现,及时干预,避免癌症终末期事件发生。而针对性调节NRP-1表达的分子也使得这一目的发现成为可能。Hang等[23]观察到NRP-1的表达与microRNA分子的表达之间存在相关性。过表达miR-9-5p可降低NRP-1的表达,还可以导致间质标志物N-钙黏蛋白(N-cadherin)和波形蛋白(vimentin)表达上调,上皮标志物E-钙黏蛋白(E-cadherin)和β-连环蛋白(β-catenin)表达下调。在胃癌(GC)发生过程中,过表达miR-9-5p可抑制细胞增殖、迁移和侵袭。miR-9-5p的过表达使GC细胞对广泛使用的抗癌药物顺铂具有更高的敏感性。

目前,抗PD-1/PD-L1药物对肿瘤具有一定缓解作用,但单独疗效并不显著,只有10%～30%的患者在接受抗PD-1/PD-L1药物后可产生持续疗效[24]。Checkmate-648项目作为全球最大的随机Ⅲ期药物试验,纳入970例全球各地晚期食管癌患者。结果表明,PD-1抑制剂+CTLA-4抑制剂双重免疫治疗相较于化疗可获得更好的中位总生存率。而在晚期肾细胞癌及黑色素瘤中,也得到了类似的结论,尼武单抗联合伊匹单抗的治疗相较于单药免疫治疗疗效显著[25-26]。目前,已有研究显示,免疫联合治疗能够使TNBC患者获得更好的肿瘤缓解率,使生存周期明显延长[27-28]。基于这一现状,可以大胆推测PD-L1和NRP-1的联合免疫治疗有利于推动分子精准医疗的发展。

综上所述,PD-L1与NRP-1在TNBC的发生发展中起到促进作用,推测NRP-1可能参与PD-L1的表达调控,促进肿瘤具有更强的转移和侵袭能力,并进一步参与肿瘤的免疫逃逸。因此NRP-1和PD-L1有望成为治疗TNBC的潜在靶点,二者的联合治疗能有效改善预后。但是二者之间具体调控机制有待后续基础研究深入探讨。本研究将PD-L1与NRP-1表达水平进行综合分析,探讨其与TNBC发生、发展的相关性。但由于本试验所取的样本量较少,可能存在一定的偏倚,还需积累更多病例进一步分析。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

马啸:提出研究思路,论文撰写;刘浩楠:病例资料收集;吕帝:统计学分析处理;崔永征:数据分析;韩正祥:指导写作,文章审核