消渴丸对2型糖尿病db/db小鼠降压降脂的拆方研究

党蕾， 宁娜， 黄秋凌， 陈健钊， 刘珊珊

（1.广州白云山中一药业有限公司，广东广州 510530；2.广州医药研究总院有限公司，广东广州 510240）

糖尿病是以慢性高血糖为特征的代谢综合征，患者常伴有高血压、血脂紊乱[1]，且这些代谢因素相互影响[1-2]。因此，在糖尿病日常防治管理中，不仅需要控制血糖，亦要重点关注血压、血脂等指标的变化。消渴丸是由中药复方与格列本脲组成的中西药复方制剂。临床研究发现，消渴丸不仅调控血糖，还显现降压、降脂的作用[3-5]。但其具体作用机制尚不完全明确。因此，本研究通过拆方方法，观察消渴丸、消渴丸纯中药部分和格列本脲对2型糖尿病db/db小鼠血压、血脂的作用，以进一步明确其降压降脂疗效及作用机制，为临床稳定2型糖尿病患者血糖的同时，对调控其血压血脂提供临床应用依据，从而为2型糖尿病的治疗提供综合策略，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物小鼠种系背景BKM 小鼠[包括：SPF 级自发性2 型糖尿病小鼠（db/db）100 只，7 周龄，雌雄各半，体质量30.9 ～41.7 g； SPF 级野生型wt/wt 小鼠20 只，7 周龄，雌雄各半，体质量14.2～22.4 g]，购自南京大学-南京生物医药研究院，生产许可证号： SCXK（苏）2015-0001。实验单位为广州医药研究总院有限公司药物非临床评价研究中心，实验动物使用许可证号：SYXK（粤）2013-0003。本研究所有实验方案均经广州医药研究总院有限公司药物非临床评价研究中心小鼠伦理委员会批准（批号：IA-PD2018008-01）。

1.2 实验药物消渴丸（每丸2.5 g，含格列本脲2.5 mg），由广州白云山中一药业有限公司提供，生产批号：YF0011；消渴丸纯中药，由广州白云山中一药业有限公司提供，生产批号：Y01461；格列本脲片，天津药物研究院药业有限责任公司生产，批号：1709009。消渴丸的制备方法：葛根265 g、地黄159 g、黄芪53 g、天花粉265 g、玉米须265 g、南五味子53 g、山药26.5 g 和格列本脲0.25 g，将葛根、地黄、玉米须、天花粉加水煎煮、滤过，滤液浓缩，黄芪、南五味子、山药粉碎成细粉，与上述部分浓缩液拌匀，干燥，粉碎，过筛，混匀，用剩余浓缩液制丸，干燥，加入格列本脲，用黑氧化铁和滑石粉的糊精液包衣，制成1 000 丸。用0.5%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）溶液分别配制消渴丸至50、200 mg/mL 两种浓度，消渴丸纯中药配至200 mg/mL，格列本脲配至0.2 mg/mL，每只动物给药容积为20 mL/kg。

1.3 主要试剂与仪器CMC-Na，天津大茂化学试剂厂产品，生产批号：20 150806；戊巴比妥钠，美国Sigma-Aldrich 公司产品，生产批号：P3761；小鼠胰岛素、血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）、过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARα）酶联免疫吸附法（ELISA）测定试剂盒均由武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司提供。BP-98A 血压计，生产厂家为日本软隆公司；GT-1640 型血糖仪，生产厂家为日本京都公司；7100型全自动生化分析仪，生产厂家为日本日立公司；电子天平：BS224S，TE601-L，BP2100，BL3100，BP3100S，生产厂家均为赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；Micro CL17 离心机，生产厂家为赛默飞世尔科技有限公司；ELx800 酶标仪，生产厂家为美国BioTek公司。

1.4 动物模型选择db/db 小鼠是Leptin 受体点突变的2 型糖尿病小鼠，为常用的2 型糖尿病研究实验小鼠模型之一，其出生后6周即可出现明显的肥胖和高血糖等糖尿病症状，8 ～12 周时最为明显，并可出现糖尿病相关并发症[6]。与诱发性糖尿病小鼠模型比较，db/db 小鼠不存在人为诱导因素的干扰，糖尿病的产生更接近临床患者发病情况，模型成功率和稳定性高，故采用db/db 小鼠作为本课题2型糖尿病模型。100只db/db小鼠与20只同窝同龄野生型wt/wt 小鼠适应性饲养结束后，禁食6 h，尾静脉穿刺采血，以空腹血糖＞11.1 mmol/L 判定2型糖尿病小鼠模型制备成功。

1.5 分组与给药将判定成功的2 型糖尿病db/db小鼠按体质量随机分为模型组，消渴丸低、高剂量组，消渴丸纯中药组和格列本脲组共5组，每组20只。同时，将20只wt/wt小鼠设为正常组。

每日早上8∶30 时，消渴丸低、高剂量组分别给予消渴丸混悬液1.0、4.0 g/kg（参照人和动物按体表面积折算的等效剂量比值[7]换算，下同，小鼠给药剂量对应为临床服用剂量折算动物等效剂量的1 倍和4 倍）灌胃；消渴丸纯中药组给予消渴丸纯中药混悬液3.996 g/kg 灌胃；格列本脲组给予格列本脲混悬液4.0 mg/kg 灌胃；正常组和模型组以动物给药容积为20 mL/kg 灌胃给予溶媒0.5%CMC-Na溶液。每日1次，连续4周。

1.6 观察指标与方法

1.6.1 血压测定 给药前、给药第4 周，在小鼠清醒状态下，采用BP-98A 血压计测定收缩压和舒张压，连续测量3 次，取其平均值即为此次测量值。

1.6.2 空腹血糖的测定 给药前、给药第4 周，禁食6 h 后，通过尾静脉穿刺采血，分离血清，应用GT-1640型血糖仪检测空腹血糖水平。

1.6.3 空腹胰岛素的测定 给药前、给药第4周，禁食6 h 后，通过尾静脉穿刺采血，分离血清，采用ELISA 法按照试剂盒说明书检测空腹胰岛素。

1.6.4 血脂的测定 给药前、给药第4 周，禁食6 h 后，通过尾静脉穿刺采血，分离血清，采用7100 型全自动生化分析仪检测血清总胆固醇（TC）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）的含量。

1.6.5 血清血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）和肝组织过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARα）的测定 在给药第4周，禁食6 h后，用3%戊巴比妥钠按2 mL/kg剂量腹腔注射麻醉小鼠，腹主动脉采血，分离血清，迅速取肝脏，采用ELISA 法按照试剂盒说明书检测血清AngⅡ含量和肝组织PPARα 的表达水平。

1.7 统计方法采用SPSS 19.0 软件进行数据分析，数据结果以均数±标准差（±s）的形式表示，多组间比较采用单因素方差分析检验，以LSD 法进行事后检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 消渴丸对2型糖尿病db/db小鼠收缩压和舒张压的影响表1 结果显示：治疗前、给药4 周后、治疗前后，各组间舒张压比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。

表1 各组小鼠血压比较Table 1 Comparison of blood pressure among various groups of mice（±s，mmHg）

表1 各组小鼠血压比较Table 1 Comparison of blood pressure among various groups of mice（±s，mmHg）

注：①P＜0.05，与正常组比较；②P＜0.05，与模型组比较

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给药前，与正常组比较，模型组收缩压显著升高（P＜0.05）；模型组和各给药组之间收缩压比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。给药4 周后，与正常组比较，模型组收缩压显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，消渴丸低、高剂量组和消渴丸纯中药组收缩压显著下降（P＜0.05），而格列本脲组收缩压无明显变化（P＞0.05）。

2.2 消渴丸对2 型糖尿病db/db 小鼠空腹血糖的影响表2结果显示：给药前，与正常组比较，模型组和各给药组空腹血糖显著升高（P＜0.01）；模型组和各给药组之间空腹血糖比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2 各组小鼠空腹血糖值比较Table 2 Comparison of fasting blood glucose among various group of mice（±s，mmol·L-1）

表2 各组小鼠空腹血糖值比较Table 2 Comparison of fasting blood glucose among various group of mice（±s，mmol·L-1）

注：①P＜0.01，与正常组比较；②P＜0.05，③P＜0.01，与模型组比较；④P＜0.05，与格列本脲组比较；⑤P＜0.05，⑥P＜0.01，与同组给药前比较

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给药4周后，与正常组比较，模型组和各给药组空腹血糖显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组空腹血糖均显著降低（P＜0.05 或P＜0.01），其中，消渴丸高剂量组和格列本脲组降低作用更明显；各给药组间两两比较，消渴丸纯中药组空腹血糖高于格列本脲组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

消渴丸高剂量组和格列本脲组给药4周后空腹血糖与治疗前比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；消渴丸低剂量组和消渴丸纯中药组空腹血糖高于治疗前（P＜0.05或P＜0.01）。

2.3 消渴丸对2型糖尿病db/db小鼠血清空腹胰岛素和HOMA-IR 的影响表3 结果显示：给药前，与正常组比较，模型组和各给药组胰岛素水平显著降低（P＜0.01），HOMA-IR 显著升高（P＜0.05）；模型组和各给药组之间胰岛素水平、HOMA-IR 比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

表3 各组小鼠血清空腹胰岛素、胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）比较Table 3 Comparison of serum insulin and insulin resistance index（HOMA-IR）among various group of mice（±s）

表3 各组小鼠血清空腹胰岛素、胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）比较Table 3 Comparison of serum insulin and insulin resistance index（HOMA-IR）among various group of mice（±s）

注：①P＜0.05，②P＜0.01，与正常组比较；③P＜0.05，与模型组比较；④P＜0.05，与同组给药前比较

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给药4周后，与正常组比较，模型组和各给药组胰岛素水平显著降低（P＜0.05 或P＜0.01），HOMA-IR显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，消渴丸高剂量组和格列本脲组胰岛素水平显著升高（P＜0.05），HOMA-IR 显著降低（P＜0.05），而消渴丸低剂量组和消渴丸纯中药组胰岛素、HOMAIR 水平与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

给药4周后，各给药组胰岛素水平与给药前比较，差异无统计学意义（P＞0.05），消渴丸高剂量组和格列本脲组HOMA-IR 则显著低于给药前（P＜0.05）。

2.4 消渴丸对2型糖尿病db/db小鼠血脂的影响表4结果显示：给药前，与正常组比较，模型组和各给药组TC 值和LDL-C 值显著升高（P＜0.01）；模型组和各给药组之间TC 值和LDL-C 值比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

表4 各组小鼠血脂水平比较Table 4 Comparison of blood lipids levels among various groups of mice（±s，mmol·L-1）

表4 各组小鼠血脂水平比较Table 4 Comparison of blood lipids levels among various groups of mice（±s，mmol·L-1）

注：①P＜0.01，与正常组比较；②P＜0.05，与模型组比较；③P＜0.05，④P＜0.01，与同组给药前比较

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给药4周后，与正常组比较，模型组和各给药组TC 值和LDL-C 值显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组TC 值和LDL-C 值显著降低（P＜0.05）；各给药组之间TC值和LDL-C值比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

各给药组给药4 周后TC 值和LDL-C 值均显著低于给药前（P＜0.05或P＜0.01）。

2.5 消渴丸对2型糖尿病db/db小鼠血清AngⅡ含量的影响表5 结果显示：给药4 周后，与正常组比较，模型组和格列本脲组血清AngⅡ含量显著升高（P＜0.05 或P＜0.01）；与模型组比较，消渴丸低、高剂量组和消渴丸纯中药组血清AngⅡ含量显著降低（P＜0.05 或P＜0.01），格列本脲组血清AngⅡ含量无显著性变化（P＞0.05）。各给药组间比较，消渴丸高剂量组和消渴丸纯中药组血清AngⅡ水平显著低于格列本脲组（P＜0.05），消渴丸高剂量组与消渴丸纯中药组之间血清AngⅡ含量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

表5 各组小鼠血清AngⅡ含量比较Table 5 Comparison of serum AngⅡcontent among various groups of mice（±s，pg·mL-1）

表5 各组小鼠血清AngⅡ含量比较Table 5 Comparison of serum AngⅡcontent among various groups of mice（±s，pg·mL-1）

注：①P＜0.05，②P＜0.01，与正常组比较；③P＜0.05，④P＜0.01，与模型组比较；⑤P＜0.05，与格列本脲组比较

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2.6 消渴丸对2型糖尿病db/db 小鼠肝组织PPARα 含量的影响表6 结果显示：与正常组比较，模型组肝组织PPARα 含量显著降低（P＜0.01）。与模型组比较，各给药组肝组织PPARα 含量显著升高（P＜0.05 或P＜0.01），其中，消渴丸高剂量组和格列本脲组的PPARα 含量升高效果与正常组相当（P＞0.05），消渴丸低剂量组和消渴丸纯中药组的PPARα 升高效果未达到正常组水平（P＜0.05）。

表6 各组小鼠肝组织PPARα含量比较Table 6 Comparison of PPARα content in liver tissue among various groups of mice（±s，ng·mL-1）

表6 各组小鼠肝组织PPARα含量比较Table 6 Comparison of PPARα content in liver tissue among various groups of mice（±s，ng·mL-1）

注：①P＜0.05，②P＜0.01，与正常组比较；③P＜0.05，④P＜0.01，与模型组比较

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3 讨论

根据2021年国际糖尿病联盟（IDF）发布的全球糖尿病报告，全球约有5.37 亿成年人患有糖尿病。2021 年《美国医学会杂志》（JAMA）上发表的最新估计显示，我国2018 年糖尿病患病率为12.4%[8]。随着我国经济的快速发展和生活水平的提升，我国糖尿病患病率呈爆发式增长[9]。

糖尿病的临床表现，除高血糖外，往往合并包括高血压、血脂异常等代谢紊乱症状[10-11]。研究[11]表明，确诊的2 型糖尿病患者中合并代谢综合征高达72.4%。2020 年版《中国2 型糖尿病防治指南》指出，糖尿病患者的血压和血脂是2个重要且可干预的风险因子，对它们的监测和控制达标与血糖的监测和控制达标同等重要。因此，对2型糖尿病患者应执行综合治疗策略，包含控糖、降血压和调控血脂等措施。

消渴丸由7味中药和格列本脲组成，临床上用于2型糖尿病治疗。临床研究结果发现，消渴丸不仅有调控血糖作用，还可降血压和降血脂[3-5]。本研究通过拆方，观察消渴丸、消渴丸纯中药部分和格列本脲对2 型糖尿病小鼠血压和血脂的作用，以期为揭示消渴丸调控血糖同时降血压降脂的疗效和机制提供理论依据，从而为2型糖尿病的治疗提供综合策略。拆方研究结果显示：在调控空腹血糖方面，消渴丸低、高剂量组，消渴丸纯中药组及格列本脲组在给药4周后空腹血糖值均明显降低，与模型组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01），而消渴丸纯中药组空腹血糖值高于格列本脲组（P＜0.05）。这表明消渴丸低、高剂量与格列本脲降低空腹血糖效果相当，单纯消渴丸纯中药部分降糖效果不甚理想，需配合格列本脲一同使用，才能发挥更优的控糖作用。

HOMA-IR 是评估胰岛素抵抗的直接指标，HOMA-IR 升高提示患者体内组织细胞对胰岛素的利用及敏感性的不足，从而影响机体对血糖的调控作用[12-13]。拆方研究结果显示：消渴丸高剂量组和格列本脲组HOMA-IR 均有降低，与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），且2 组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；消渴丸纯中药组HOMA-IR 与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。这提示消渴丸控制血糖作用可能主要与消渴丸中格列本脲成分缓解胰岛素抵抗有关。

针对收缩压指标，本研究结果显示，与模型组比较，消渴丸低、高剂量组和消渴丸纯中药组给药4 周后收缩压明显降低（P＜0.05），而格列本脲组收缩压无显著变化（P＞0.05）。这表明消渴丸降血压作用主要是通过降低收缩压而实现的。已有研究证实，AngⅡ水平升高具有强收缩血管作用，还可引起血管内皮细胞功能紊乱，促进血管内皮细胞炎症形成，促进动脉粥样硬化发生，从而加重高血压的进展[14-15]。拆方研究结果显示：与模型组比较，消渴丸低、高剂量组和消渴丸纯中药组给药4 周后血清AngⅡ水平均显著降低（P＜0.05 或P＜0.01），格列本脲组血清AngⅡ含量无显著变化（P＞0.05）；消渴丸高剂量组与消渴丸纯中药组之间血清AngⅡ含量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。这提示消渴丸降血压作用可能主要与消渴丸纯中药组分抑制AngⅡ分泌有关。

针对血脂指标，拆方研究结果显示：给药4周后，与模型组比较，消渴丸低、高剂量组TC 值和LDL-C 值均显著下降，差异有统计学意义（P＜0.05），且LDL-C 降低程度呈一定量效关系；格列本脲组TC 值和LDL-C 值亦低于模型组（P＜0.05），但TC 值和LDL-C 值下降作用不及消渴丸高剂量组；同时，与给药前比较，各给药组TC 和LDL-C在给药4 周后均显著降低（P＜0.05 或P＜0.01）。该结果表明，消渴丸调控血脂作用是中西药组分协同作用的结果，消渴丸中药组分与格列本脲协同作用才能达到血脂调控的最佳疗效，与前期组分研究报道结论相符[16]。PPARα 是参与脂肪酸代谢的关键蛋白酶[17]，本研究后续检测各组在给药4 周后肝组织PPARα 的含量，结果显示，各给药组肝组织PPARα 水平较模型组显著升高（P＜0.05 或P＜0.01），其中，消渴丸高剂量组肝组织PPARα 水平最高，提示消渴丸可促进脂肪酸代谢，加速其分解，实现调控血脂稳态，而单纯格列本脲用药，无法达到最佳治疗2型糖尿病血脂异常的效果。

综上所述，本研究证实了消渴丸不仅具有调控血糖，也有降压和降血脂的疗效，其疗效是消渴丸纯中药部分和西药格列本脲部分协同作用的结果。消渴丸调控2型糖尿病小鼠血糖主要由西药组成部分格列本脲抑制胰岛素抵抗起作用，而通过纯中药部分抑制AngⅡ降低收缩压而实现控制血压，通过中药部分和西药部分协同升高肝组织PPARα 表达进而调控血脂；但具体调控机制仍有待深入挖掘。