基于GC-MS分析刺五加和短梗五加不同器官的代谢差异特性

2023-05-21任艳君郭晓瑞徐明远邵文达吴可心

植物研究 2023年3期

任艳君孙宇郭晓瑞* 徐明远邵文达吴可心

（1.东北林业大学化学化工与资源利用学院，哈尔滨 150040；2.黑龙江生态工程职业学院，哈尔滨 150025；3.黑龙江中医药大学，哈尔滨 150040；4.东北林业大学林学院，哈尔滨 150040）

五加属（Acanthopanax）植物在全球大约有37种，我国拥有26 个种18 个变种。东北地区比较常见的有刺五加（Acanthopanax senticosus）、短梗五加（A.sessiliflorus）。刺五加作为药用植物，在史料文献中有大量记载，其根部、茎部及叶均可入药［1］，早在汉代《神农本草经》中就将刺五加列为无毒、久服可以轻身、延年益寿无害的上品［2］。短梗五加虽未被列为我国药典中药材，但其在2008 年被原国家卫生部批准为新资源食品。现代医学研究表明，刺五加和短梗五加均具有抗肿瘤的药理作用，对癌细胞侵袭能够实现转移干预的作用［3］。但是，二者在药效上也存在差异，刺五加较多应用在免疫调节和抗疲劳上［4-5］，而短梗五加则主要应用于镇痛、抗炎和抗氧化［6-8］。两种药用植物作为重要的林下经济植物资源，开发利用潜力巨大，但刺五加和短梗五加因在形态特征上无明显差异而经常被混用。目前，在东北三省刺五加产地及药材集散地市场上经常将短梗五加与刺五加混淆，很多短梗五加产品被当作刺五加进行功效宣传和销售［9］。因此，短梗五加能否替代刺五加作为药材使用是制约两种植物药用研究发展的一个重要问题。此外，不同的器官药用成分种类和含量存在差异［10-11］，选取短梗五加的哪一器官替代刺五加是另一重要问题。

为解决上述问题，国内学者就刺五加和短梗五加的差异做了大量的研究，研究方向主要集中在对2个物种次生代谢产物及药理活性的比较上，如王宇［12］利用LC-MS 技术对二者次生代谢物组分的研究显示，10 种药用代谢物在短梗五加与刺五加中的分布具有显著差异。刘枞等［13-14］对比2 物种根皮和茎皮中有效成分含量发现，短梗五加根皮样品中刺五加苷B 和刺五加苷E 的含量显著低于刺五加根皮，茎皮中异嗪皮啶及刺五加苷E 的含量显著高于刺五加茎皮。王晶瑶［15］对2 种药用植物叶及果镇静催眠活性的研究表明，短梗五加叶和果提取物的镇静催眠作用不如刺五加。芮施等［16］对刺五加和短梗五加根皮乙醇提取物对小鼠的镇静催眠作用的研究显示，在镇静催眠方面，短梗五加根皮可作为刺五加根皮的替代品。

然而目前关于刺五加和短梗五加初生代谢方面的报道还较少。植物次生代谢产物以初生代谢产物为前体，利用初生代谢产生的能量，通过不同的代谢途径生成［17］。刘紫祺等［18］通过适当的提高对西洋参（Panax quiquefolium）的光照强度，增强了初生代谢强度，有利于植物积累生物量，进而促进次生代谢产物的合成。Chen 等［19］发现长春花（Catharanthus roseus）和小蔓长春花（Vinca minor）初生代谢物的不同可能是二者生物碱类次生代谢产物的累计存在差异的原因之一。基于GC-MS的植物代谢组学技术是研究种间、种内差异性的有效手段之一，Yao 等［20］利用该技术发现了2 种不同栽培区域枸杞（Lycium chinense）果实的代谢差异性；Okba 等［21］利用该技术分析了3 种鸢尾属（Iris）植物的初生代谢谱，发现3种植物地下部分有着显著的代谢差异。

因此，本研究利用GC-MS 代谢组学分析技术构建刺五加和短梗五加初生代谢谱，对其初生代谢物进行分析。通过多元统计分析的方法分析刺五加和短梗五加不同器官初生代谢差异特性，为进一步揭示2物种的药效差异机制提供研究基础，为明确两者药用价值及资源利用结构提供思路。综上，对刺五加和短梗五加不同器官代谢差异的研究对揭示两物种药理效应和次生代谢差异的相关机制具有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 材料

试验所用材料均来自于森林植物生态学教育部重点实验室（东北林业大学）温室外苗圃，经东北林业大学穆立蔷教授鉴定确定为5年生刺五加、短梗五加。植物样品于2020 年10 月上旬一次性采集，包括刺五加和短梗五加的根、茎、叶、叶柄4 个部位，每个部位随机采集3 个生物学重复，共24个样本。采回后将其洗净简单处理后放置于冰箱中-80 ℃保存备用。

1.2 试剂与仪器

甲醇（色谱级，北京百灵威科技有限公司）、L2-氯-苯丙氨酸（阿拉丁）、甲氧胺盐酸盐（上海笛柏生物科技有限公司）、BSTFA（含1%TMCS）衍生试剂（阿拉丁）、正已烷（分析纯，天津市富宇精细化工有限公司）、氯仿（济南汇丰达化工有限公司）、吡啶（阿拉丁）。

气相色谱质谱联用仪（7890A-5975C，美国），电子天平（BSA224S-CW，德国），数控超声波清洗机（KQ500-DB，昆山），高速离心机（TGL-16，湖南），气浴恒温振荡器（SHZ-82A，常州），电热恒温水浴锅（DK98-ⅡA，天津），高通量组织研磨机（Xinyi-24，宁波），真空离心浓缩仪（ZLS-2，湖南）。

1.3 样品的制备

称取刺五加和短梗五加根、茎、叶、叶柄样品各0.09 g，分别放入2 mL 的离心管中。依次加入2颗小钢珠，540 µL的冷甲醇和60 µL的内标（L-2-氯-苯丙氨酸，0.3 g·L-1，甲醇配置）。在冰箱中-80 ℃放置2 min，放入研磨机中研磨（60 Hz）2 min后取出继续超声提取30 min。取出1颗小钢珠，加入300 µL 的氯仿，研磨机中涡旋（20 Hz）2 min，加入600 µL 的水，研磨机中涡旋（20 Hz）2 min，超声提取30 min。低温离心（14 000 r·min-1，4 ℃）10 min，取700 µL 的上清液，装入玻璃衍生瓶中，快速离心浓缩仪挥干。向玻璃衍生小瓶中加入400 µL 的甲氧胺盐酸吡啶溶液（15 g·L-1），涡旋震荡2 min 后，于震荡培养箱中37 ℃肟化反应90 min。取出后再加入400 µL 的BSTFA（含1%TMCS）衍生试剂和60 µL 的正己烷，涡旋震荡2 min 后，于70 ℃反应60 min，取出样品，室温放置30 min，进行GC-MS代谢组学分析。

1.4 数据处理和多元统计分析

使用Agilent GC-MS 5975 软件处理数据，并采用XCMS 软件包进行数据的特征峰提取和预处理。将预处理完毕的数据矩阵归一化后导入SIMCA14.1 软件进行PCA 分析和PLS-DA 等多元统计分析，得到各变量对分组贡献得分（VIP 值）大于1的代谢物。利用IBM SPSS Statistics 22.0 做独立样本t检验，得到组间变化显著的（P＜0.05）代谢物。利用MetaboAnalyst 网站计算差异倍数，得到|log2FoldChange|＞2 的代谢物。将VIP＞1，P＜0.05且|log2FoldChange|＞2的代谢物作为差异代谢物，并将差异代谢物输入到KEGG数据库和MetaboAnalyst数据库进行代谢途径的筛选。使用GraphPad Prism 8.0.2对差异代谢物含量进行对比，做出柱形图。

2 结果与分析

2.1 PCA分析

首先利用无监督的主成分分析（PCA）方法来判断刺五加和短梗五加是否具有初生代谢差异。在PCA分析的二维得分图（见图1）中，刺五加和短梗五加并没有被明显的区分开，这是由于PCA 为无监督的分析方法，样本中存在不同物种的差异同时也存在不同器官的差异，导致影响因素过多而不能明显区分。但通过PCA 分析的三维得分图（见图2）可知，刺五加各样本处于下方，短梗五加的各样本处于上方，可以明显区分。

图2 刺五加和短梗五加初生代谢PCA三维得分图Fig.2 Three-dimensional score chart of primary metabolism PCA of A.senticosus and A.sessiliflorus

2.2 PLS-DA分析

PCA 分析结果显示刺五加和短梗五加同一部位在初生代谢上有明显的差异，为了更加准确地显示2种五加属植物间的代谢差异、筛选出差异代谢物，使用最小二乘法（PLS-DA）模型进行进一步分析。从PLS-DA 得分图（见图3）可以看出，刺五加与短梗五加同一部位存在差异。如表1 所示，R2X均大于0.7，Q2均大于0.9，说明模型稳定。且PLS-DA 模型的置换检验（见图4）显示，Q2和R2的斜率均为正值，证明模型无过拟合的现象。

图4 刺五加和短梗五加不同器官初生代谢PLS-DA置换检验A.根；B.茎；C.叶；D.叶柄Fig.4 PLS-DA substitution test for primary metabolism in different organs of A.senticosus and A.sessiliflorusA.Roots；B.Stems；C.Leaves；D.Petioles

2.3 两种植物样品间的差异代谢物确定

基于PLS-DA 分析的结果得到VIP 值大于1的代谢物，经过独立样本t检验筛选P＜0.05 的代谢物，计算差异倍数，得到|log2FoldChange|＞2 的代谢物，最终得到根差异代谢物52个，茎差异代谢物34个，叶差异代谢物39个，叶柄差异代谢物48个。

2.4 差异代谢物通路分析

通过MetaboAnalyst 做差异代谢物代谢途径分析，结果如图5所示。根中差异代谢物主要富集在氨酰基-tRNA 合成途径、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成途径、乙醛酸和二羧酸代谢途径等；茎中差异代谢物主要富集在半乳糖代谢途径、淀粉和蔗糖代谢途径；叶中差异代谢物主要富集在乙醛酸和二羧酸代谢途径、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢途径、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢途径；叶柄中差异代谢物主要富集在半乳糖代谢途径、精氨酸合成代谢途径、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢途径。

图5 刺五加和短梗五加不同器官初生代谢差异代谢物富集通路气泡图A.根；B.茎；C.叶；D.叶柄Fig.5 Bubble diagram of primary metabolism differential metabolite enrichment pathway in different organs of A.senticosus and A.sessiliflorusA.Roots；B.Stems；C.Leaves；D.Petioles

2.5 连接初生代谢与次生代谢的重要中间体相对含量

本研究中发现4 种初生代谢物，分别是莽草酸、苯丙氨酸、苯甲酸和咖啡酸，其在生成次生代谢物的途径中有着关键性作用，且在2物种中的相对含量存在差异。

图6 为莽草酸、苯丙氨酸、苯甲酸和咖啡酸在刺五加和短梗五加不同器官的峰面积。莽草酸在刺五加中的含量是短梗五加中的3.18 倍，主要分布在根、茎中，在刺五加中的含量远高于短梗五加，刺五加根中的含量是短梗五加根中的2.78 倍，刺五加茎中的含量是短梗五加茎中的4.97 倍，其他部位含量差距较小。苯丙氨酸在刺五加中的含量是短梗五加中的0.61 倍，在短梗五加根中含量最高，是刺五加根中含量的6.75 倍，刺五加茎中含量是短梗五加茎的2.81 倍，刺五加叶中含量是短梗五加叶的4.08 倍，短梗五加叶柄中的含量是刺五加中的1.22 倍。苯甲酸在刺五加中的含量是短梗五加的0.39 倍，在短梗五加根和叶柄中远高于刺五加，短梗五加根中含量是刺五加根的4.87 倍，短梗五加叶柄中含量是刺五加叶柄中的11.21 倍。咖啡酸在刺五加中的含量是短梗五加中的0.73倍，在短梗五加叶中含量最高，是刺五加叶中含量的4.24 倍，刺五加根中含量是短梗五加中的3.45倍，刺五加茎中含量是短梗五加中的4.04 倍，刺五加叶柄中的含量是短梗五加中的1.47倍。

图6 莽草酸（A）、苯丙氨酸（B）、苯甲酸（C）和咖啡酸（D）4种关键化合物在刺五加和短梗五加不同器官峰面积a.刺五加根；b.短梗五加根；c.刺五加茎；d.短梗五加茎；e.刺五加叶；f.短梗五加叶；g.刺五加叶柄；h.短梗五加叶柄Fig.6 Peak areas of four key compounds including shikimic acid（A），phenylalanine（B），benzoic acid（C）and caffeic acid（D）in different organs of A.senticosus and A.sessiliflorusa.A.senticosus roots；b.A.sessiliflorus roots；c.A.senticosus roots；d.A.sessiliflorus stems；e.A.senticosus leaves；f.A.sessiliflorus leaves；g.A.senticosus petioles；h.A.sessiliflorus petioles

3 讨论

植物代谢对于植物的生长发育尤为重要，这是因为植物代谢过程中产生的代谢物在植物生长、细胞补充，以及植物应对环境改变带来的胁迫等方面发挥着重要作用。植物的代谢产物是植物生长、源—库平衡及适应环境变化的关键因素，更是植物生理、生长状态在代谢水平的反映［22］。本研究中，PCA 和PLS-DA 分析结果显示刺五加与短梗五加在初生代谢水平存在差异。相同器官分别对比分析，结果显示根中差异代谢物52个，茎中差异代谢物34个，叶中差异代谢物39个，叶柄差异代谢物48 个。利用差异代谢物进行代谢通路富集分析，结果显示根和叶涉及的差异代谢通路较茎和叶柄更多。2种植物根和叶中涉及的差异代谢通路大多与氨基酸代谢和糖类能量代谢有关，还涉及氨酰基-tRNA生物合成途径，茎和叶柄中差异代谢通路主要是糖类能量代谢。因此，差异代谢物的数量和差异代谢通路的种类表明，2种植物根的差异更大。

氨基酸是人体生存必需的一种营养物质，不仅有提高人体免疫力的作用，还有加强肠胃吸收的功效。本研究中，天冬氨酸、甘氨酸、L-苏氨酸、缬氨酸、亮氨酸等在刺五加中含量均低于短梗五加，推测短梗五加的食用价值更高一些，这与蔡恩博等［23］对刺五加和短梗五加叶片成分分析结论一致。五加科植物均以皂苷类化合物为主要活性物质，如人参（Panax ginseng）、三七（P.notoginseng）等［24］，刺五加总苷具有明显的抗疲劳及抑制肿瘤细胞生长的作用［25］，以往的研究结果表明刺五加中的皂苷物质含量高于短梗五加，刺五加的药用价值更高。但多糖类、黄酮类、酚酸类也是具有一定活性的代谢产物［26］。本研究中，检测到的大多数的糖类物质的含量在刺五加中低于短梗五加，郑冉等［27］对短梗五加多糖提取分离并进行了体外活性研究，结果表明短梗五加多糖能够减轻心肌细胞损伤并抑制氧化应激反应、线粒体途径的凋亡，同时具有免疫调节活性。肖凤艳等［28］研究表明短梗五加果实中含有酚类物质并有抗疲劳作用。酚类化合物主要由苯丙基类生物途径合成，苯丙氨酸是其途径的重要前体，莽草酸是连接初生代谢和次生代谢的关键代谢物，苯丙氨酸可由莽草酸生成，再生成其他酚类物质。本研究中，莽草酸在刺五加中的含量远高于短梗五加，而短梗五加中苯丙氨酸、苯甲酸和咖啡酸的含量高于刺五加。基于以上分析，推测刺五加药用价值大于短梗五加，但刺五加和短梗五加不同器官的活性成分类别和含量存在差异，如在多糖类、酚酸类作为药用主要活性成分时，短梗五加有替代刺五加的潜力。