基于微小RNA-146a探究川陈皮素对帕金森病模型的神经保护作用

董柏萍 王永生 吕静静 韩燕珍 袁锁伟 梁 永 毛蕾蕾

曹县人民医院 1. 神经内科； 2. 神经外科； 3. 病理科，山东 曹县 274400； 4. 山东第一医科大学（山东省医学科学院）第二附属医院神经内科，山东 泰安 271000

帕金森病（Parkinson’s disease， PD）是世界上第二大神经退行性疾病［1］。该疾病主要特征为中脑黑质致密部多巴胺能神经元的变性缺失，导致纹状体内多巴胺含量的显著减少，临床表现主要为静止性震颤、运动减少、肌肉强直及步态异常等。PD 的发病缓慢、病程较长，表现为疾病的进行性加重，严重影响患者的运动能力和生活质量［2］。目前临床上多采用拟多巴胺类药物、多巴胺受体激动剂、单胺氧化酶抑制剂等进行PD 患者的控制治疗，虽然这些药物能够在一定程度上缓解患者的临床症状，但无法调控神经元凋亡以及疾病的发展，同时还会伴随一些精神方面的副作用［3-4］，因此亟需开发有效阻止PD进展的神经保护药物。

川陈皮素（nobiletin）是一种常见的O-甲基化类黄酮，是柑橘类食品中的一类多酚类化合物，具有抗氧化、抗癌、抗炎等一系列生物活性，此外在胰岛素抵抗、肝保护、抗动脉粥样硬化以及神经营养等方面也发挥着重要作用。研究证实了川陈皮素在神经保护方面的功效，Yasuda 等［5］证明了川陈皮素具有抑制脑缺血再灌注损伤的神经保护功能；Kimura等［6］则在阿尔茨海默病模型中证明了川陈皮素能够显著降低β-淀粉样蛋白水平，从而抑制疾病的发展。Braidy 等［7］及Nakajima 等［8］分别对川陈皮素在PD 中潜在的神经保护功能进行了阐述。然而，现阶段对川陈皮素在PD 中发挥药效的作用机制了解甚少，严重阻碍了对川陈皮素的药物开发及PD治疗的发展。

微小RNA（microRNAs， miRNAs）是一类不具有蛋白编码功能的小RNAs，在机体中能够调节多种细胞功能，如细胞增殖、转移、侵袭、分化和凋亡等［9］。研究表明，miRNAs 参与多种疾病的进展，并发挥调控甚至改善疾病的作用，其中作为人类中枢神经系统中表达最为丰富的miRNAs 之一，miR-146a 被证实参与多种神经系统疾病的调控［10］，例如，增加海马体中miR-146a的表达可以改善阿尔兹海默病模型的认知障碍［11］，且miR-146a也被证实可影响硬化症患者的易感性［12］。

本研究在建立PD 细胞和动物模型的基础上，通过对miR-146a表达、神经细胞活力及炎症因子水平的检测，结合小鼠的运动水平分析，探索miR-146a 介导川陈皮素对PD 的调控功能，为患者的治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 PD细胞模型和动物模型的构建

神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）购买于美国菌种保藏中心（ATCC），于添加了10%胎牛血清的DMEM 培养基（Invitrogen， 美国）中进行培养，设置含有5% CO2培养箱为37 ℃。使用5 μmol/L 鱼藤酮（Sigma，美国）诱导SH-SY5Y 细胞共24 h，用以构建PD细胞模型（PD模型组）。使用不同浓度的川陈皮素处理PD细胞12 h，分别获得低剂量组（25 μmol/L）、中剂量组（50 μmol/L）和高剂量组（100 μmol/L）的PD细胞。同时以SH-SY5Y细胞作为对照组。

8周龄的雄性C57BL/6小鼠30只来自北京维通利华实验动物有限公司，通过标准方法正常饲养，并将小鼠分为5 组，每组6 只。使用1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶［MPTP；30 mg/（kg·d）］持续灌胃小鼠5 d建立PD小鼠模型［13-14］。同样利用不同浓度的川陈皮素对小鼠进行处理，获得低剂量组（25 μmol/L）、中剂量组（50 μmol/L）和高剂量组（100 μmol/L）的PD 小鼠模型。取PD 小鼠的血液和海马组织样本制作血清和脑组织匀浆，并在-80 ℃冰箱中保存备用。

1.2 细胞转染和动物处理

将miR-NC、miR-146a 激动剂和miR-146a 抑制剂在Lipofectamine 3000 试剂的帮助下分别转染到经川陈皮素处理的PD 细胞模型中，得到高剂量+miR-NC 组、高剂量+miR-146a 激动剂组和高剂量+miR-146a抑制剂组。

利用侧脑室置管术处理小鼠，待应激反应消失后，经导管将miR-NC、miR-146a 激动剂、miR-146a抑制剂（10 μL）分别导入小鼠，连续进行5 d。给药结束48 h后，利用MPTP经上述方法构建PD小鼠模型，获得高剂量+miR-NC组、高剂量+miR-146a激动剂组和高剂量+miR-146a抑制剂组小鼠模型。

1.3 荧光定量PCR实验

按照说明书的要求，使用TRIZOL 试剂（Thermo，美国）提取样本中的总RNA，并通过分光光度计测定RNA 的纯度和浓度。使用反转录试剂盒ReverTra Ace qPCR RT kit（Toyobo， 日本）将RNA反转录为cDNA，以获得的cDNA 作为模板，使用SYBRGREEN qPCR 试剂盒（Vazyme，南京）配置反应体系，并在ABI 7500进行PCR反应，U6作为内参基因，用2-ΔΔCt法计算miR-146a的相对表达量。

1.4 细胞增殖、凋亡检测

接种细胞至96 孔细胞培养板，于37 ℃培养箱中培养3 d，在每孔中每24 h 加入CCK-8 检测试剂，孵育2 h 后，使用酶标仪检测各细胞培养孔在450 nm处的吸光度值。

用流式细胞术检测细胞凋亡情况，收集PD 细胞，彻底清洗后使用Annexin-FITC 和PI 进行双染，最后通过流式细胞仪分析细胞的凋亡情况。

1.5 小鼠旷场试验

将各组小鼠依次置于观察箱中央，观察并记录小鼠5 min 内的总运动距离、中央格停留时长及站立次数，期间禁止任何形式的人工干预，及时对观察箱进行清洁，排除气味等外部因素的影响。

1.6 炎症因子的表达检测

使用酶联免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA）试剂盒分别检测小鼠模型血清和海马组织匀浆中炎症因子的表达水平，包括白介素-1β（interleukin-1β， IL-1β）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）。

1.7 统计学分析

采用SPSS 23.0软件处理和分析数据。计量资料用均数±标准差表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。为保证实验的准确性，每组实验至少重复3 次。检验水准α= 0.05。

2 结 果

2.1 miR-146a的差异化表达及不同浓度川陈皮素对PD细胞活性的影响

以SH-SY5Y细胞作为对照组，经实时荧光定量PCR（real time quantitative PCR， RT-qPCR）验证发现，PD细胞模型中miR-146a表达升高，当不同浓度的川陈皮素介导后，随着剂量的增加，miR-146a 的表达逐渐下降，且高剂量组对miR-146a 表达的影响最为显著。CCK-8 试验提示，PD 模型组细胞的增殖水平较对照组明显下降，而川陈皮素的介导则会增加细胞的增殖水平。同样地，细胞凋亡实验证实了PD 模型组细胞凋亡率上调，而随着川陈皮素剂量的增加，细胞凋亡率下降。详见表1。

表1 不同浓度川陈皮素对细胞增殖和凋亡的影响

2.2 miR-146a激动剂和miR-146a抑制剂介导的川陈皮素对PD细胞的调控

分别将miR-NC、miR-146a 激动剂或miR-146a 抑制剂共转染到高剂量川陈皮素处理过的PD模型组细胞中，成功构建高剂量+miR-NC组、高剂量+miR-146a激动剂组和高剂量+miR-146a抑制剂组，并采用RTqPCR检测miR-146a的表达水平，高剂量+miR-146a激动剂组中miR-146a的表达明显高于对照组，而高剂量+miR-146a 抑制剂组中miR-146a 的表达下降。与PD模型组相比，转染高剂量+miR-146a激动剂后，细胞增殖能力下降，而转染高剂量+miR-146a抑制剂后，细胞增殖能力升高，即miR-146a表达水平的增加会抑制PD细胞的增殖能力。miR-146a表达水平的增加会明显增加细胞的凋亡率，详见表2。

表2 高剂量川陈皮素参与下miR-146a对细胞增殖和凋亡的影响

2.3 异常表达miR-146a对小鼠运动能力的影响

探究异常表达miR-146a 介导川陈皮素对PD细胞的影响后，进一步构建PD 小鼠模型，并对小鼠的运动情况进行观察和记录（表3）。相比健康的对照组小鼠，PD 小鼠的活动距离明显减少，停留时间增加，同时站立次数骤减。当加入川陈皮素后，随着剂量的增加，发现小鼠的运动能力得到恢复，尤其是高剂量组小鼠，活动距离和站立次数明显增加，同时中央格停留的时间相对减少。

表3 不同浓度川陈皮素处理的帕金森病小鼠旷场实验

2.4 异常表达miR-146a 对PD 小鼠模型中炎症因子的调控

进一步对小鼠血清和脑组织中的炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α 的表达水平进行检测。相比健康对照组，PD小鼠模型组中IL-1β、IL-6和TNF-α水平均升高；经川陈皮素处理后，炎症因子水平有所下降，且下降程度随川陈皮素剂量的增加而显著，高剂量组效果最明显（表4）。

表4 不同浓度川陈皮素对帕金森病小鼠血清和组织中炎症因子的调控

此外，经miR-146a 激动剂和miR-146a 抑制剂介导后发现，miR-146a 的增加会导致PD 小鼠模型血清和组织中炎症因子水平相对增加，而miR-146a的减少则会使PD小鼠模型血清和组织中炎症因子水平相对下降（表5）。

表5 异常表达miR-146a对帕金森病小鼠血清和组织中炎症因子的影响

3 讨 论

PD严重影响患者的运动功能和生活质量，目前临床常用的治疗药物无法抑制PD 进展，且多伴副作用的发生，给患者造成了巨大的压力［15］。

川陈皮素是一种天然的类黄酮，是一种有益的抗氧化剂，具有抗炎和抗癌活性［16］。研究表明，川陈皮素在肿瘤治疗、糖尿病认知功能障碍、心脑血管疾病等方面有一定功效，同时在神经保护方面也有大量研究［17-19］。Zheng 等［20］证明了川陈皮素通过调控AKT/mTOR 和TLR4/NF-κB 信号通路改善缺血性脑损伤。Bi等［21］证实，川陈皮素能够缓解麻醉剂引起的认知功能障碍、神经炎症以及神经元凋亡。本研究发现，川陈皮素的增加能显著影响PD 模型组中miR-146a的表达以及细胞增殖和凋亡能力；在PD 小鼠模型中，川陈皮素能有效改善PD 小鼠的运动能力，帮助小鼠恢复正常的生存状态，同时降低小鼠血清和组织中炎症因子的表达水平。因此提示，川陈皮素对PD 的治疗有积极的功效，对PD 患者可能起神经保护作用。

文献证实，miR-146a 参与肿瘤、自身免疫性疾病、心血管疾病的调控［22-24］。在创伤性脑损伤（traumatic brain injury， TBI）的治疗研究中，通过构建TBI 患者和动物模型评估发现，miR-146a 在TBI小鼠的大脑和血清中均上调。miR-146a 处理可减轻TBI对小鼠大脑的影响，改善小鼠的神经功能［25］。类似地， miR-146a激动剂和miR-146a抑制剂介导高剂量川陈皮素处理的PD细胞模型发现，miR-146a激动剂会抑制细胞活性，增加细胞凋亡数量；miR-146a抑制剂的作用则相反。miR-146a 抑制剂的介导会使PD小鼠模型血清和组织中炎症因子显著下降，减轻症状。上述研究表明，miR-146a介导川陈皮素对PD 模型有明显的治疗功效，具有更具体、更深入的临床研究价值。

文献证实，SH-SY5Y 细胞经鱼藤酮诱导后，RT-qPCR 检测发现miR-146a 在细胞中上调表达［26］，这与本研究结果一致。此外，在Guo 等［27］探究南蛇藤醇对PD 的保护机制中也发现miR-146a上调表达。在相关神经退行性疾病的研究中了解到包括miR-146a、miR-155 和miR-21 在内的一些miRNAs 炎症调节因子在多发性硬化症患者的病变中也被发现为过表达［28-29］。在类风湿关节炎患者血清中miR-146a 表达同样呈上调趋势［30］。然而，miR-146a的表达情况还存在一些争议，也有研究表明miR-146a在PD患者中表达下调［31-32］。因此，在后续的研究中还需要进一步扩大样本量以验证本研究的结论。

综上，miR-146a在PD细胞模型中明显高表达，川陈皮素的参与能有效提高PD 细胞的增殖水平，减少细胞凋亡，并且在一定程度上恢复PD 小鼠的运动能力。异常表达miR-146a 通过介导川陈皮素对PD 细胞活力和炎症因子起调控作用，是后续研究PD有潜力的治疗靶点。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲