食品中牛、羊、猪、马源性成分检测能力验证结果与分析

◎ 苏妙贞，杨丹婷，丁清龙，周 露

（广东省食品检验所，广东 广州 510435）

肉类是动物的皮下组织及肌肉，肉类食品含有丰富的蛋白质，通常是人们饮食中的重要组成部分[1]。近年，社会接连出现肉类食品掺假或以次充好的问题，如2013 年欧洲的“马肉风波”，在多款冷冻牛肉食品中检出马肉成分[2]。另外，还有个别不法商人低价购入猪肉掺入价格更高的牛肉[3]或羊肉中、将低价风干鸭肉干冒充为牦牛干等。为保障消费者的利益及食品质量安全，动物源性成分检测具有重要的社会意义。

中国检验检疫科学研究院测试评价中心（ACAS）是中国合格评定国家认可委员会认可的能力验证提供者，能对参加者的结果进行评价[4]。能力验证是检验实验室能力的重要手段之一，参加能力验证对于持续提高实验室检测水平和质量控制具有重要意义。本实验室于2022 年5 月参加了ACAS 组织的食品中牛、羊、猪、马源性成分检测能力验证ACAS-PT1397（2022）。选用SN/T 2051—2008[5]进行牛、羊源性成分检测；SN/T 3730.5—2013[6]进行马源性成分检测；SN/T 3730.8—2013[7]进行猪源性成分检测，并用BJS 201904[8]对猪源性成分检测结果再确认。

1 材料与方法

1.1 实验材料

2 个样品由ACAS 提供，为肉类产品，呈肉糜状，铝箔袋真空包装，重约10 g，编号为22-K950、22-W704；阴性样品为市场购买的鸡肉样品；阳性样品为市场购买的牛肉、羊肉、猪肉、马肉样品；实验用水为无菌ddH2O。

1.2 仪器与试剂

ME203 天平（美国梅特勒-托利多科技有限公司）；AB2-3S1 生物安全柜（新加坡ESCO 公司）；Nano 核酸蛋白分析仪（日本岛津企业管理有限公司）；CFX-96 实时荧光PCR 仪（美国伯乐公司）；Quant Studio 6 Flex 实时荧光PCR 仪（美国赛默飞世尔科技公司）；Centrifuge 5430 离心机（德国艾本德公司）

DNA 提 取 试 剂 盒（ 德 国QIAGEN 公 司）；Premix Ex TaqTM（Probe qPCR）（ 日 本TaKaRa 公司）；Real Time PCR Bovine DNA Detection Kit（日本TaKaRa 公司）；Real Time PCR Ovine DNA Detection Kit（日本TaKaRa 公司）；内参照、猪源性成分的正向引物、反向引物、探针按照SN/T 3730.8—2013 和BJS 201904，马源性成分的正向引物、反向引物、探针按照SN/T 3730.5—2013 提供的序列信息由生工生物工程上海股份有限公司合成。

1.3 实验方法

参照组织方提供的参试指导书、SN/T 2051—2008、SN/T 3730.8—2013、SN/T 3730.5—2013 和BJS 201904进行实验。

1.3.1 样品DNA 提取

分别取样品约200 mg，取样尽量均匀。根据DNA 提取试剂盒说明书步骤提取样品DNA，每个样品提取3 个平行样。提取过程同时取200 μL 水作为提取空白对照，与样品同时进行DNA 提取。用核酸蛋白分析仪测定DNA 浓度、A260及A280的比值，将DNA 浓度统一用水稀释至50 ng·μL-1进行后续实验。

1.3.2 牛、羊源性成分PCR 扩增

用CFX-96 实时荧光PCR 仪，按照SN/T 2051—2008 进行牛、羊源性成分检测。反应体系：总体积为25 μL，其中包括2×premix 12.5 μL，引物（10 μmol·L-1）混合 液1 μL，探 针（10 μmol·L-1）1 μL，模 板DNA 2 μL，水8.5 μL。反应条件：95 ℃预变性10 s，1 个循环；95 ℃变性5 s，60 ℃退火延伸30 s，40 个循环，在每次循环的退火时收集荧光。

1.3.3 猪源性成分PCR 扩增

用Quant Studio 6 Flex 实时荧光PCR 仪，先按照SN/T 3730.8—2013 进行猪源性成分检测。反应体系：总体积为25 μL，其中包括2×premix 12.5 μL，引物（10 μmol·L-1）各1 μL，探 针（10 μmol·L-1）1 μL，模板DNA 2 μL，水7.5 μL。反应条件：50 ℃预变性2 min，95 ℃预变性10 min，1 个循环；95 ℃变性15 s，58 ℃退火延伸1 min，45 个循环，在每次循环的退火时收集荧光。

对需要再确认的样品，用Quant Studio 6 Flex 实时荧光PCR 仪按照BJS 201904 进行猪源性成分检测。反应体系：总体积为20 μL，其中包括2×premix 10 μL，引物（10 μmol·L-1）各0.2 μL，探针（10 μmol·L-1）0.1 μL，模板DNA 1 μL，水8.5 μL。反应条件：95 ℃预变性5 min，1 个循环；95 ℃变性15 s，58 ℃退火延伸1 min，35 个循环，在每次循环的退火时收集荧光。

1.3.4 马源性成分PCR 扩增

用CFX-96 实时荧光PCR 仪，按照SN/T 3730.5—2013 进行马源性成分检测。反应体系：总体积为25 μL，其中包括2×premix 12.5 μL，引物（10 μmol·L-1）各1 μL，探针（10 μmol·L-1）1 μL，模板DNA 2 μL，水7.5 μL。反应条件：94 ℃预变性1 min，1 个循环；94 ℃变性34 s，60 ℃退火延伸45 s，40 个循环，在每次循环的退火时收集荧光。

1.3.5 质量控制

每个实验过程均设置阳性对照、阴性对照、试剂空白对照及提取空白对照。试剂空白对照即用水代替模板；提取空白对照即在样品DNA 提取过程中，用水代替样品与样品同时进行DNA 提取；荧光PCR 实验的每个样品各加2 个平行孔。结果根据SN/T 2051—2008、SN/T 3730.8—2013、SN/T 3730.5—2013、BJS 201904 要求进行判定。

2 结果与分析

2 个样品各提取3 个平行样的A260和A280比值均在1.8 ～2.0，说明DNA 浓度较高，提取效果较好[9]。在猪源性成分PCR 扩增实验中，按照SN/T 3730.8—2013 要求做的样品内参照（18S rRNA 基因）均有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，Ct 值均＜30，证明有提取到动物源性DNA，符合实验要求。

本次实验设置的阳性对照、阴性对照、试剂空白对照及提取空白对照均符合要求，实验结果有效。两个样品的牛、羊、猪、马成分检测结果根据相应检测标准判定。各样品的检测结果详见表1。

表1 各样品的检测结果表

样品22-W704 的3 个平行样的4 个检测检测项目结果基本一致，可得出相同结论。样品22-K950 的3个平行样品的牛、羊、马源性成分结果也基本一致，可得出相同结论。用SN/T 3730.8—2013 检测的猪源性成分判定结果出现不一致的情况：两份样品未检出猪源性成分，一份样品检出猪源性成分但Ct 值（36.951、39.309）较大。将相同3 个平行样用BJS 201904 进行实验，按BJS 201904 检验和判定均未检出猪源性成分（表2），增强了22-K950 的猪源性成分检测结果为未检出的信心。

表2 22-K950 猪源性成分用BJS 201904 检测结果表

最终结果为样品22-K950 检出羊源性成分，未检出牛、猪、马成分；样品22-W704 检出牛、羊、猪源性成分，未检出马源性成分（表3）。

表3 能力验证上报结果表

3 结论与讨论

将最终实验结果上报至ACAS，结果均为满意。证明本实验室有能力进行动物源性成分的检测，也是对本实验室的充分肯定。本次能力验证，开阔了检测人员的思路并积累了经验，促进了本实验室能力的提升。

本实验用了两种方法确认样品22-K950 的猪源性成分检测结果。方法比较能提高结果准确性和检测能力，为实验室能力验证结果填报提供了参考，提高实验室报出结果的把握[10]。根据经验，在结果判定时，需结合Ct 值和扩增曲线进行综合判定[11]。分析本实验样品22-K950 用SN/T 3730.8—2013 检测，有一份Ct 值（36.951、39.309）较大的情况，其扩增曲线并不十分典型，考虑为假阳性。结合BJS 201904 判定结果，得出该样品未检出猪源性成分的结论。对该样品，虽然BJS 201904 的Ct 值大于35 判定未检出，仍未达到SN/T 3730.8—2013 检测的Ct 值36.951 和39.309，但用SN/T 3730.8—2013 检测猪源性成分上报结果为未检出的能力验证结果评价为满意，则说明SN/T 3730.8—2013 和BJS 201904 得出的未检出猪源性成分实验结果均可靠。

荧光PCR 结果出现假阳性的可能原因有实验耗材污染、阳性样本和阳性对照造成的污染[12]、样品制作过程环境交叉污染等。由于本实验的空白对照、提取对照结果均符合要求，则认为本实验猪源性成分检测所出现的情况很可能是样品在制样过程交叉污染导致的。

荧光PCR 技术有灵敏度高、特异性强的特点，广泛应用于肉制品中物质的定性和定量分析[13]。由于该技术的极高敏感性，样品采集、提取过程的污染及环境气溶胶污染容易导致结果假阳性。为预防以上情况出现，实验室应区分试剂准备区、核酸提取区、产物扩增区、产物分析区；实验人员应严格按照检测方法操作；使用的耗材如PCR 管应无菌无酶等[14]。对肉类检测，基于DNA 生物学层面的分析技术除了荧光PCR 法外，还有常规PCR、数字PCR、等温扩增检测技术、DNA 条形码和下一代测序等技术[15]。