雷公藤红素通过NF-κB阻断尿酸钠晶体诱导的痛风性关节炎大鼠炎性分子表达

曹帆帆, 张登海, 杨哲军, 王 莹, 徐莉敏

(1. 上海市浦东新区公利医院·上海市炎症与慢病管理人工智能重点实验室,上海 200135;2. 上海市浦东新区高行社区卫生服务中心检验科,上海 201208; 3. 上海市浦东新区公利医院检验科,上海 200135)

痛风性关节炎(gouty arthritis, GA)是由于嘌呤代谢紊乱,导致血液尿酸浓度过高,继而沉积在关节组织后引起的炎症反应,发作期典型临床表现为突发的关节红肿热痛,常见于第一跖趾关节,受累关节剧痛,治疗以抗炎镇痛为主[1-3]。目前,GA发作时,秋水仙碱为其首选药物。但是,秋水仙碱是一种高毒性生物碱,其中毒剂量与治疗剂量相近,常引发如腹泻等胃肠道不良事件,有严格的禁忌证和明显的毒副作用[4-5]。因此,寻找新的药物用于急性痛风性关节炎的治疗,有重要的临床意义。

雷公藤俗称断肠草、山砒霜,系卫矛科雷公藤属植物,其主要功效作用是治疗肾炎、皮肤病、类风湿性关节炎等[6-8]。雷公藤红素是我国学者从雷公藤根部提炼出的第一个醌甲基三萜类化合物。本团队和其他的研究均发现,在多个实验动物疾病模型中,雷公藤红素显示出对多种炎症具有治疗潜能[9-11]。研究认为,GA是由尿酸钠晶体(monosodium urate monohydrate crystals, MSU)沉积在关节周围而引起的炎症反应。MSU沉积可引起关节液中炎症因子水平显著升高,从而导致关节及周围组织局部充血水肿,发生炎症反应。因此,由MSU诱导的GA动物模型可模拟人类GA的发病机制[12-13]。本研究拟观察雷公藤红素对MSU诱导的痛风性关节炎大鼠的治疗作用,并初步探讨其作用的可能机制,为雷公藤红素治疗痛风性关节炎提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 试剂

雷公藤红素购自美国Sigma公司,由上海中山医院药剂科提取及纯化,方法见以前报道[14]。尿酸(货号U2875)购自美国Sigma公司;苏木精和伊红染料(BASO)、IL-8和COX-2 ELISA试剂盒购自武汉贝茵莱生物科技有限公司;GDPH引物和IL-8试剂盒由上海捷瑞生物工程有限公司合成;NO检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所;RIPA组织细胞快速裂解液(货号R0010)购自北京索莱宝科技有限公司;BCA蛋白定量试剂盒(货号PICPI23223)购自美国赛默飞公司;发光液(货号WBKLS0100)购自美国密理博公司;p-P65(货号Ab89299)和Rabbit抗Rat P65(货号Ab16502)购自英国艾博抗公司;羊抗兔HRP标记二抗(货号A0208)购自上海碧云天生物技术公司。

1.2 主要仪器

石蜡切片机(型号SQ 2125)、荧光显微镜(型号DM 6000 B)为德国Leica公司生产;正置显微镜(型号CX 41)为日本Olympus公司生产;酶标仪(型号352型)为芬兰MS公司生产;Real-time检测仪(型号ABI-7300)为美国ABI公司生产;电泳仪(型号mini protean 3 cell)为美国BIO-RAD公司生产;电转仪(型号PS-9)为大连竞迈科技有限公司生产;成像系统(型号T anon-5200)为上海Tanon公司生产。

1.3 动物实验

1.3.1 实验动物 雄性SD大鼠,180200 g,购自上海斯莱克实验动物有限公司。

1.3.2 模型制备 1 g尿酸溶解于200 mL沸水中(含6 mL 1 N NaOH),加入盐酸,调节溶液的最终pH值至7.2。将溶液冷却并在室温下搅拌,然后在4 ℃储存过夜。沉淀物过滤、低温干燥,并过孔径250 pm的金属网筛过筛,然后,尿酸结晶(大小为525 μm)混合在0.9%盐水的注射液[含10% Tween-80(吐温-80)],终浓度为20 mg/mL。模型制备前,测量大鼠左、右后足踝关节下0.5 mm处的周长作为0 h测量值。乙醇消毒双后足脚踝处,用4号注射针头,取20 mg/mL的尿酸钠混悬液50 μL,注入大鼠右后支内踝的胫跗关节腔内,大鼠左侧注射相同体积的PBS作对照。

1.3.3 动物分组及处理 实验分为4组,每组4只大鼠: 对照组(腹腔注射雷公藤红素溶解液DMSO),雷公藤红素组(简称红素组),MSU诱导的模型组和雷公藤红素干预组(MSU+cel,简称红素干预组)。16 h后重新测量鼠左、右后足踝关节下0.5 mm处的周长,处死动物,分别收集滑膜和软骨以及关节腔内组织液,进行后续检测。

1.4 病理切片

滑膜和软骨置于10%甲醛中固定48 h;经过洗涤、脱水、透明、浸蜡和包埋处理后,组织切成厚约47 μm的组织片,然后进行HE染色,最后进行封片。结果用显微镜(200倍)观察。

1.5 ELISA检测

按试剂说明书操作。每孔加入50 μL不同浓度标准品及40 μL样品,空白对照孔加入同体积标准品稀释液。每孔继而加入10 μL稀释过的生物素化抗体。封板膜盖上,37 ℃孵育30 min。弃去孔内液体,每孔加入300 μL 1×洗涤液;静置1 min后,弃去孔内液体,并拍干。洗涤重复3次。每孔再加入50 μL Streptavidin-HRP,盖上封板膜后室温孵育20 min。弃去孔内液体,每孔加入300 μL 1×洗涤液;静置1 min后,弃去孔内液体,拍干。洗涤重复3次。每孔加入100 μL TMB,室温避光,孵育1030 min。每孔加入终止液50 μL,选择波长450 nm的酶标仪,10 min内读取吸光度(A450)值。按标准曲线计算样品中细胞因子含量。

1.6 Real-time PCR

1.6.1 组织处理及总RNA提取 取组织于1 mL的TRIzol的匀浆管中,于匀浆机匀浆20 s,立即放于冰上;然后置于超净台中,温育5 min,12 000 r/min,离心10 min(离心半径10 cm);吸取上清液,并加入氯仿200 μL,摇匀,室温静置2 min。于4 ℃ 12 000 r/min,离心10 min(离心半径10 cm);吸取上清液,加入异丙醇600 μL,混匀,室温静置15 min。于4 ℃ 12 000 r/min,离心15 min(离心半径10 cm),弃上清液;加入1 mL 75%无水乙醇漂洗,于4 ℃ 12 000 r/min,离心5 min(离心半径10 cm),弃上清液;加入1 mL无水乙醇,漂洗,于4 ℃ 12 000 r/min,离心5 min(离心半径10 cm),弃上清液,室温干燥10 min;加入40 μL DEPC水溶解RNA,置于-80 ℃保存备用。

1.6.2 cDNA制备 提取的RNA首先进行DNA消除,然后进行反转录(体积为25 μL)。取1 ng的RNA与1.5 μL Olig-dT 12-18及6 U(在生物酶中使用U表示限制性内切酶的活性单位,1 min内能转化1 μmol底物的酶量称为1酶单位)RNA酶抑制剂混合,以30 U AMV反转录酶于37 ℃作用1 h,85 ℃ 5 min,4 ℃,5 min后,获得cDNA,可作为后续PCR反应模板。

1.6.3 Real-time PCR扩增 采用荧光定量PCR试剂盒。反应液组成(体积为25 μL): cDNA模板为2 μL(双蒸水稀释3倍),qPCR预混液12.5 μL,IL-8上下游引物(引物F 5′-CAATGAGTCGGCTG-GAGAAC-3′,Primer R 5′-AGGTGCTGAAGTCCTT-AGGG-3′)各0.5 μL,加双蒸水至25 μL。GAPDH内参引物(Primer F 5′-GTCGGTGTGAACGGA-TTTG-3′,Primer R 5′-TCCCATTCTCAGCCTTGAC-3′)。反应程序: 反应程序: 95 ℃,10 min(95 ℃,15 s;60 ℃,45 s)×40;95 ℃,15 s;60 ℃,1 min;95 ℃,15 s;60 ℃,15 s。数据采用仪器自带软件(ABI Prism 7300 SDS 软件)进行分析。

1.7 NO检测

按试剂说明书进行NO检测。对照液、待测样本和标准液各100 μL,分别加入产品中试剂一和试剂二各200 μL,混匀,37 ℃,水浴60 min。然后再分别加入产品中试剂三和试剂四200 μL和100 μL,充分旋涡混匀30 s,室温静置10 min,3 5004 000 r/min,离心10 min,取上清液500 μL与显色剂600 μL混合,室温静置10 min,550 nm测各管吸光度(A550)值。

1.8 western印迹法检测

蛋白样品中加入上样缓冲液,95 ℃煮5 min,制备好的蛋白样品冻存于-20 ℃备用。取适量蛋白上样,同时上样蛋白分子量标记。将电压调至100 V进行电泳分离,待蛋白进入分离胶层后,将电压调至200 V,继续进行电泳分离至溴酚蓝条带跑出胶外。将电压调至100 V转膜90 min。剪下所需条带,封闭液室温封闭2 h。再加入抗P65和p-P65抗体,4 ℃孵育过夜。用TBST液洗膜3次,每次10 min,再加入相应二抗,室温孵育1 h,并用TBST洗膜3次,每次10 min,最后用化学发光法显影检测。

1.9 统计学处理

2 结 果

2.1 雷公藤红素对痛风性关节炎大鼠足肿胀的影响

用尿酸钠注射后,观察不同的时间点发现到16 h模型组大鼠才观察到变化,因此选择16 h时间点作为观察点。与对照组相比,16 h后,尿酸钠晶体导致模型组大鼠踝关节明显肿胀,两组差异有统计学意义(P<0.01),见图1A。雷公藤红素干预组与模型组相比,作用16 h后,没有观察到雷公藤红素对尿酸钠晶体导致的足肿胀有抑制作用(P>0.05),表明雷公藤红素本身对SD大鼠的踝关节没有影响(图1B)。对照组大鼠滑膜组织无炎性细胞浸润,无组织水肿及血管充血等现象。组织细胞间距疏松,且排列有序,均匀一致。模型组大鼠滑膜组织表层受损,增生明显,血管内充血、管腔变形增大,炎性细胞排列紧密,且紊乱簇集。与模型组相比,相同倍数视野中,雷公藤红素干预组炎性细胞数量更少,炎性细胞排列间距更为疏松,且血管充血现象明显减少(HE,200倍),见图1C。

图1 雷公藤红素对痛风性关节炎大鼠足肿胀的影响Fig.1 Effect of celastrol on foot swelling in rats with gouty arthritisA: 尿酸钠晶体作用16 h后,大鼠踝关节明显肿胀;B: 大鼠左后足踝关节足周长作为对照,右后足踝关节足周长与对照相比作为纵坐标数值,MSU诱导的模型组踝关节明显肿胀,而雷公藤红素对尿酸钠晶体导致的足肿胀无抑制作用,**P<0.01;C: 各组踝关节组织切片图

2.2 雷公藤红素对痛风性关节炎大鼠关节腔液炎性分子分泌的影响

与对照组相比,尿酸钠晶体对踝关节有强烈刺激作用,模型组大鼠关节腔液内的炎性分子IL-8和COX-2水平升高,两组差异有统计学意义(P<0.01)。雷公藤红素本身对SD大鼠关节腔液内的炎性分子IL-8和COX-2水平没有影响,与对照组相比,两者差异无统计学意义(P>0.05),但能抑制尿酸钠导致的炎性分子IL-8和COX-2水平升高;红素干预组与模型组相比,两组差异有统计学意义(P<0.01),见图2A、B。

图2 雷公藤红素对痛风性关节炎大鼠关节腔液炎性分子分泌的影响Fig.2 Effect of celastrol on secretion of inflammatory molecules in joint cavity fluid of rats with gouty arthritisA: 各组大鼠关节腔液IL-8水平比较;B: 各组大鼠关节腔液COX-2水平比较;**P<0.01

2.3 雷公藤红素对痛风性关节炎大鼠关节滑膜和软骨组织IL-8 mRNA转录的影响

与对照组相比,尿酸钠晶体会强烈刺激踝关节,模型组大鼠关节软骨和滑膜组织的炎性分子IL-8 mRNA转录水平显著增加,两组差异有统计学意义(P<0.01)。雷公藤红素本身对SD大鼠关节滑膜和软骨组织的炎性分子IL-8 mRNA转录水平没有影响,与对照组相比,两者差异无统计学意义(P>0.05),但能显著抑制尿酸钠导致的炎性分子IL-8 mRNA水平升高(图3A、B);红素干预组与模型组相比,两组差异有统计学意义(P<0.01)。

图3 雷公藤红素对痛风性关节炎大鼠关节滑膜和软骨组织IL-8 mRNA转录的影响Fig.3 Effect of celastrol on IL-8 mRNA transcription in synovial and cartilage tissues in rats with gouty arthritisA: 各组大鼠滑膜组织IL-8 mRNA转录水平比较; B: 各组大鼠软骨组织IL-8 mRNA转录水平比较;**P<0.01

2.4 雷公藤红素对痛风性关节炎大鼠踝关节NO水平的影响

与对照组相比,尿酸钠晶体对踝关节有强烈刺激作用,模型组大鼠关节腔液内的NO水平升高,两组差异有统计学意义(P<0.01)。雷公藤红素本身对SD大鼠关节腔液内的NO水平没有影响,与对照组相比,两者差异无统计学意义(P>0.05),但能抑制尿酸钠导致的炎性分子NO水平升高;红素干预组与模型组相比,两组差异有统计学意义(P<0.01),见图4。

图4 雷公藤红素对痛风性关节炎大鼠踝关节NO水平的影响Fig.4 Effect of celastrol on NO levels in ankle joint of rats with gouty arthritis**P<0.01

2.5 雷公藤红素对痛风性关节炎大鼠滑膜组织NF-kB活化的影响

与对照组相比,尿酸钠晶体对踝关节有强烈刺激作用,模型组大鼠关节滑膜组织的P65活化显著增加,两组差异有统计学意义(P<0.01)。雷公藤红素本身对SD大鼠关节滑膜关节滑膜组织的P65活化没有影响,与对照组相比,两者差异无统计学意义(P>0.05),但能显著抑制尿酸钠导致的关节滑膜组织P65的活化;红素干预组与模型组相比,两组差异有统计学意义(P<0.05),见图5。

图5 雷公藤红素对痛风性关节炎大鼠滑膜组织NF-kB活化的影响Fig.5 Effect of celastrol on activation of NF-kB in synovium of rats with gouty arthritisA: Western印迹法检测条带图;B: p-P65统计图;**P<0.01,*P<0.05

2.6 雷公藤红素对痛风性关节炎大鼠软骨细胞NF-kB活化的影响

与对照组相比,尿酸钠晶体对踝关节有强烈刺激作用,模型组大鼠关节软骨组织的P65活化显著增加,两组差异有统计学意义(P<0.01)。雷公藤红素本身对SD大鼠关节软骨组织的P65活化没有影响,与对照组相比,两者差异无统计学意义(P>0.05),但能显著抑制尿酸钠导致的关节软骨组织P65的活化;红素干预组与模型组相比,两组差异有统计学意义(P<0.05),见图6。

图6 雷公藤红素对痛风性关节炎大鼠软骨组织NF-kB活化的影响Fig.6 Effect of Tripterygium on activation of NF-kB in cartilage of rats with gouty arthritisA: Western印迹法检测条带图;B: p-P65统计图;**P<0.01,*P<0.05

3 讨 论

尿酸钠结晶析出并沉积于关节滑膜组织内,导致关节组织释放炎性因子,引发无菌性炎症,是GA发作的主要机制之一。因此,研究认为,治疗急性痛风性关节炎的主要策略是阻断关节组织释放炎性因子[4,15]。本团队最近的研究发现,雷公藤红素能抑制MSU导致的关节组织释放炎性因子,这种作用与其抑制转录因子NF-κB活化有关。

急性痛风性关节炎的病理实质是炎症,其病理机制为血管的异常,包括血管扩张,炎性渗出,炎性分子的表达在红、肿、热这几方面起主要作用,并引起中性粒细胞等炎性细胞在炎症部位的聚集。在急性痛风性关节炎发作时,尿酸钠导致关节组织分泌炎性介质如IL-8、COX-2、NO等,这些介质能募集中性粒细胞到达炎症部位,引发炎症的级联反应[16]。在动物模型中,MSU诱导的大鼠急性痛风性关节炎,能导致模型鼠踝关节肿胀,本研究首先观察雷公藤红素对关节肿胀的作用,结果发现仅仅干预16 h雷公藤红素未能缓解模型鼠的足肿胀,这可能与雷公藤红素作用时间过短有关,雷公藤红素的干预效果有待进一步观察。但是,本研究在观察雷公藤红素对MSU导致的炎性介质表达升高的作用时发现,在蛋白水平,雷公藤红素能抑制MSU导致的炎性分子IL-8和COX-2水平升高,在转录水平,雷公藤红素对IL-8的转录有强烈的抑制作用。另外,NO在痛风性关节炎中亦起重要作用。本研究也观察了雷公藤红素对MSU诱导的NO生成的影响,结果与其他研究观察一致,MSU能诱导关节组织生成NO增加,而雷公藤红素能抑制其诱导的NO生成。

近年的多个研究表明,MSU晶体作为一种危险信号,能与单核/巨噬细胞表面的蛋白CD14/16结合,刺激细胞膜表面Toll样受体4(Toll-like receptor 4, TLR 4)[17-18]。TLR4与髓样分化因子(my-eloid differentiation factor88, MyD88)结构中的羧基端产生作用,募集白细胞介素-1受体相关激酶(IRAK),IRAK被活化后作用于TNF受体相关因子6(TRAF6),并在IκB激酶(IκB Kinase, IKK)催化下激活NF-κB,活化的NF-κB通路可调节诸多炎性因子的合成和释放,介导炎性反应完成。与其他研究相符,本研究也观察到,MSU能导致关节的滑膜和软骨组织表达与炎性相关的转录因子NF-κB表达增加,并且活性明显升高。在这过程中,雷公藤红素对滑膜和软骨组织的NF-κB表达量和磷酸化均有明显的抑制作用,这表明雷公藤红素抑制MSU导致的炎性介质的释放,与其抑制NF-κB表达和活化有关。研究认为,雷公藤红素可能是通过直接作用于IKK而抑制NF-κB的活性[19]。IKK是NF-κB信号通路的一个关键成员。在非活化状态,NF-κB被抑制蛋白IκB隔离至细胞质中,受到外界刺激后,IKK被激活,从而使IκB蛋白磷酸化,最终导致NF-κB活化,转位至细胞核内促进多种基因的转录。研究发现,雷公藤红素能够有效抑制IKK的激活,从而阻止NF-κB的核转位[20]。

综上所述,雷公藤红素在体内能抑制MSU导致的炎性介质IL-8、COX-2和NO的释放,这种抑制效果与其能抑制MSU导致的NF-κB表达和活化有关。这些研究表明,雷公藤红素作为治疗急性痛风性关节炎的候选药物,值得进一步研究。