ST11型KPC-2和NDM-1联产肺炎克雷伯菌流行病学特征分析*

周佳佳,赵树龙,宋爽,康海全1,

(1.徐州医科大学医学技术学院,江苏徐州221000;2.淮安市妇幼保健院医学检验科,江苏淮安 223002;3.徐州医科大学附属医院检验科,江苏徐州221000)

肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae,KP)是一种临床常见的条件致病菌,可以引起肺部、肝脏、尿道、血液、大脑等全身多部位感染[1-2],特别是抵抗力低下和有基础疾病患者。曾经碳青霉烯类药物被视为阻击革兰阴性杆菌的最后一道防线,但是目前碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌(carbapenemase-resistantKlebsiellapneumoniae,CRKP)检出率越来越高。中国细菌耐药监测报告显示,KP对主要碳青霉烯类药物(亚胺培南和美罗培南)耐药率从2007年2.4%和2.9%分别增长至2021年23.1%和24.4%,上升幅度高达10倍[3-4]。一项多中心队列研究中揭示了全球不同地区的CRKP高死亡率[5]。因此,CRKP的防控已成为全球关注的公共卫生问题。

CRKP的主要耐药机制是产碳青霉烯酶。我国CRKP主要产肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(KPC)[6],NDM、OXA-48次之。随着碳青霉烯酶抑制剂的广泛使用,B类金属酶的检出率逐年增加,目前国内外已相继报道同时产A类和B类碳青霉烯酶的CRKP[7-8],这给临床的抗感染治疗提出了新的挑战。但是对于联产碳青霉烯酶菌株的流行病学信息尚不完善,因此本研究将对KPC-2和NDM-1联产的CRKP菌株从流行病学、分子分型、耐药机制和同源性进行分析,为临床合理用药和医院感染监测提供依据。

1 材料与方法

1.1菌株来源 筛选徐州医科大学附属医院2021年6月至12月临床首次分离的CRKP菌株。本研究已通过徐州医科大学附属医院伦理委员会批准(批文号:XYFY2021-KL101-01)。

1.2试剂与仪器 微生物标本自动接种培养仪(武汉DIASE公司),MALDI-TOF MS质谱仪(BD公司),Vitek 2 Compact全自动微生物鉴定分析仪及GN鉴定卡(法国生物梅里埃公司),PCR仪、脉冲场电泳仪、凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司);头孢他啶/阿维巴坦药敏纸片(意大利Liofilchem公司),替加环素药敏试剂(温州康泰生物公司),Taq DNA聚合酶、PCR相关试剂、脉冲场凝胶电泳(pulsed field gel electrophoresis, PFGE)使用相关试剂、DNA marker和XbaⅠ内切酶(大连宝生物公司),琼脂糖及溴化乙锭(美国Promega公司)。PCR扩增引物由上海生工生物公司合成。

1.3方法

1.3.1菌株鉴定与药物敏感性试验 所有菌株均使用MALDI-TOF MS鉴定,用Vitek 2 Compact全自动微生物鉴定分析仪进行菌株确认及药敏检测,药敏结果判读参照2021年美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)标准。亚胺培南或者美罗培南任一药物耐药均认定为CRKP菌株。头孢他啶/阿维巴坦使用K-B法,取浊度为0.5～0.63麦氏浊度单位的待测菌液,均匀涂布于M-H琼脂平板,37 ℃培养18～20 h后量取最小抑菌圈大小,≥21 mm为敏感,≤20 mm为耐药。质控菌株:肺炎克雷伯菌ATCC 700603。

1.3.2耐药基因检测 使用煮沸法提取DNA,用PCR法扩增碳青霉烯酶基因(blaKPC、blaNDM、blaVIM、blaIMP、blaOXA-48)、超广谱β-内酰胺酶基因(blaCTX-M、blaSHV、blaTEM)。引物序列和条件参照相关文献[9]。引物及退火温度见表1。扩增产物行15 g/L琼脂糖凝胶电泳分析,阳性扩增产物委托上海生工生物公司进行Sanger测序,测序仪器为美国ABI公司3730XL测序分析仪。

表1 耐药基因引物及退火温度

1.3.3多位点序列分型(multilocus sequence typing, MLST) 参照网站(https://bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/primers-used/)合成肺炎克雷伯菌7个管家基因(rpoB、pgi、tonB、mdh、phoE、gapA、infB)引物,进行 PCR 扩增。PCR反应体系共25 μL,包括上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL,PCR混合液12.5 μL,ddH2O 8.5 μL,DNA模板2 μL。PCR反应参数:94 ℃预变性2 min;94 ℃变性30 s,50 ℃退火1 min,72 ℃延伸30 s,35个循环;72 ℃延伸5 min。扩增产物电泳及序列分析方法同1.3.2。

1.3.4PFGE同源性分析 包埋细菌:取培养18 h的肺炎克雷伯菌与沙门菌H9812标准菌株2～3个菌落,分别加入2 μL细胞悬浮液中研磨均匀。将菌液与1%低熔点胶1∶1混匀加入模具中,待其凝固。细菌裂解:将包埋细菌的小胶块加入5 mL浓度为0.1 mg/mL蛋白酶K的细胞裂解液中震荡2 h。清洗胶块:将裂解好的小胶块以超纯水冲洗2遍,TE缓冲液冲洗3遍。然后用XbaⅠ酶切2 h,再灌制凝胶后跑胶18 h(电压:6 V/cm;初始时间:6 s;最终时间:36 s;电场夹角:120°;初始电流:120～140 mA),溴化乙锭染色30 min,最后放在凝胶成像仪中成像。PFGE图谱相似度超过85%判定为同一克隆型[10]。

2 结果

2.1耐药基因及MLST分型 2021年6月至12月共分离出239例CRKP,经耐药基因分析,其中检测出3株KPC-2和NDM-1联产CRKP,并均检出β-内酰胺酶基因,MLST结果显示均为ST11型。见图1、图2、表2。

注:M,DNA marker;1、2,blaNDM基因阴性菌株;3、4、5,blaNDM基因阳性菌株。

注:M,DNA marker;1、5,blaKPC基因阴性菌株;2、3、4,blaKPC基因阳性菌株。

表2 3株KPC-2和NDM-1联产CRKP耐药基因分析结果

2.2药物敏感性试验结果 药敏结果显示,3株KPC-2和NDM-1联产CRKP菌株对青霉素类、头孢菌素类、喹诺酮类、氨基糖苷类和碳青霉烯类100%耐药,且均呈高水平耐药,3株联产CRKP对新药头孢他啶/阿维巴坦(Ceftazidime/avibactam,CZA)均显示耐药,其中K2菌株替加环素中介,无多黏菌素耐药株。见表3。

2.3PFGE同源性分析 结果显示,本次检出的3株联产CRKP中有2株图谱高度相似,同源性>90%。见图3。

图3 3 株KPC-2和NDM-1联产肺炎克雷伯菌PFGE图谱分析

3 讨论

本研究检出的3株KPC-2和NDM-1联产CRKP均属于ST11,且有2株PFGE同源性>90%,说明局部存在KPC-2和NDM-1联产CRKP的流行传播。ST11型是我国主要流行分子型,其次是ST15[11]。除了中国,ST11在日本、泰国、德国、希腊、意大利、波兰、巴西、奥地利、印度、以色列、美国等多个国家被广泛检测出。因此,ST11型CRKP作为国际高危克隆,应当引起更多的关注和重视。

马筱玲教授团队回顾分析了2 462例感染CRKP患者,发现CRKP感染的死亡率(42.14%)高于碳青霉烯酶敏感的肺炎克雷伯菌(CSKP)的死亡率(21.16%),并且血流感染、入住ICU、器官移植感染CRKP死亡率排前三,分别是54.30%、48.90%、43.13%[12]。本院3例联产CRKP患者均来自ICU,死亡率高达100%,高于马教授等的研究,这可能是因为联产CRKP增加了临床抗感染治疗的难度。但是由于国内外报道的联产例数还较少,危险因素与转归情况还有待进一步研究。

本研究中,3例KPC-2和NDM-1联产CRKP菌株均属于多药耐药菌,且均呈现高水平耐药,这可能由于体内存在2种碳青霉烯酶基因共同拮抗的效果。这2种碳青霉烯酶中,KPC酶属于A类丝氨酸β-内酰胺酶,NDM酶属于B类金属酶,都能够水解β-内酰胺类药物,包括青霉素类、头孢菌素类和碳青霉烯类[13]。不同的是KPC酶可以水解单环内酰胺类药物,但会被许多抑制剂抑制,NDM酶不能水解单环内酰胺类药物,但对阿维巴坦有抑制作用[14]。因此,blaKPC和blaNDM同时携带将会被获得更高的耐药性,这对临床治疗提出更大的挑战。本研究中,3株KPC-2和NDM-1联产CRKP均对CZA耐药,而NDM酶对CZA有抑制作用[15],所以表现出了更高的耐药性。另外有研究报道,用替加环素治疗CRKP可能会导致替加环素耐药性的发展[16],本研究中有1例K2药敏结果显示对替加环素中介,根据抗菌药物使用史阿米卡星+替加环素+氟康唑+卡泊芬净,推测K2菌株患者替加环素的使用诱导了该菌的抗药性,替加环素的耐药加剧了抗感染的困难。

目前,联产碳青霉烯酶CRKP不断被报道,除了KPC-2和NDM-1组合,还有一些新的组合[17],如KPC-OXA、VIM-OXA甚至有KPC-NDM-VIM三联产组合。但是这种碳青霉烯酶联产菌株的进化机制和传播机制尚不完全明确。国内对联产碳青霉烯酶CRKP的少量研究[18]发现,blaKPC-2基因优先发现于IncFⅡ质粒,而blaNDM-1基因位于不同的背景,如IncN、IncX和IncHI1B质粒,其进化途径可能是KPC-2-CRKP获得了高度可转移的NDM-1质粒,同时该研究还发现这种联产的CRKP可以稳定遗传。综上所述,联产CRKP的微生物学特性表明,KPC-2和NDM-1联产CRKP可以同时携带blaKPC-2和blaNDM-1并稳定遗传,同时也可引起广泛的流行传播。