托珠单抗联合甲氨蝶呤治疗类风湿关节炎患者细胞免疫指标变化特点*

汪达青,朱珈漩,王芳,司马赟,王卓,何春燕

(苏州大学附属第二医院检验科,江苏苏州215004)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一类基于滑膜关节慢性炎症的自身免疫病,通常表现为关节肿胀和压痛,进而累及全身器官。为避免患者进行性关节损伤,降低患者致残率及死亡率,RA诊断明确后需尽早使用合理药物治疗,以达到缓解病情、控制进程的目的。临床常用的改善RA症状的药物包括抗风湿药、糖皮质激素、非甾体抗炎药和炎性细胞因子抑制剂[1]。近年来,IL-6受体抑制剂托珠单抗由于其安全性高、疗效好在临床广泛应用。本研究就托珠单抗联合甲氨蝶呤治疗前后RA患者细胞因子水平及外周血淋巴细胞亚群比例进行分析,探讨治疗对患者各免疫指标的影响,以期为其疗效观察提供更灵敏、准确的参考。

1 资料与方法

1.1研究对象 纳入苏州大学附属第二医院2021年12月—2022年7月RA患者22例,其中男性2例,女性20例,年龄(56.6±12.4)岁,年龄范围31～72岁,病程(6.65±5.95)年,病程范围0.7～20年。纳入标准:(1)年龄20～75岁;(2)符合2010年ACR/EULAR类风湿关节炎分类诊断标准[2];(3)临床及实验室信息完整;(4)托珠单抗以8 mg/kg每4周静脉滴注1次,联合甲氨蝶呤每周10 mg口服,治疗12周。排除标准:(1)同时接受除托珠单抗和甲氨蝶呤外其他抗风湿药物联合治疗;(2)同时患有其他自身免疫病;(3)活动性病毒和细菌感染;(4)恶性肿瘤患者;(5)合并严重心脑血管疾病;(6)严重肝肾功能不全者。本研究获医院伦理委员会批准(JD-HG-2022-62)。

1.2疾病活动度评估 采集患者年龄、性别、病程等个体特征资料,以及治疗前、后C反应蛋白(CRP)与血细胞沉降率(ESR)数据,计算DAS28评分,计算公式为:DAS28=[0.56×sqrt(T28)+0.28×sqrt(SW28)+0.70×Ln(ESR)]×1.08+0.16,其中T28表示触痛的关节数,SW28表示关节肿胀数,sqrt为开平方根,Ln为取自然对数,根据DAS28评分和CRP变化评价治疗前后疾病活动程度[3]。

1.3主要仪器与试剂 BD FACSCanto Ⅱ流式细胞仪、人Th1/Th2/Th17细胞因子检测试剂盒(货号560484)、10×Lysing缓冲液(货号555899)、荧光标记单克隆抗体(美国BD公司);PBS缓冲液(中国Biosharp公司,货号BL302A)。

1.4标本采集与制备 采集治疗前、后患者空腹外周静脉血,肝素抗凝管采血量为4 mL,促凝血清管采血量为3.5 mL。肝素抗凝血采集后立即进行流式检测,促凝管静置1 h后3 000 r/min离心15 min,分离血清于4 ℃保存,每周统一测定细胞因子。

1.5流式检测免疫细胞亚群 移液器吸取50 μL肝素抗凝血至流式管底部,加入相应流式抗体混匀,室温避光反应15 min,加入红细胞裂解液2 mL,避光裂解5 min,离心,弃上清液,PBS洗涤2次后细胞沉淀以300 μL PBS悬浮,上机检测,检测方案如下。(1)T淋巴细胞亚群。调节性T细胞(regulatory cells, Treg):CD3+CD4+CD25+CD127-;CD4+/CD8+初始T细胞(CD4+/CD8+naive T cells,CD4+/CD8+TN):CD45+CD3+CD4+/CD8+CD45RA+CD197+;CD4+/CD8+中央记忆T细胞(CD4+/CD8+central memory T cells,CD4+/CD8+TCM):CD45+CD3+CD4+/CD8+CD45RA-CD197+;CD4+/CD8+效应记忆T细胞(CD4+/CD8+effector memory T cells,CD4+/CD8+TEM):CD45+CD3+CD4+/CD8+CD45RA-CD197-;CD4+/CD8+活化中央记忆T细胞(CD4+/CD8+activated central memory T cells, acti-CD4+/CD8+TCM):CD38+HLA-DR+CD4+/CD8+TCM;CD4+/CD8+活化效应记忆T细胞(CD4+/CD8+activated effector memory T cells,acti-CD4+/CD8+TEM):CD38+HLA-DR+CD4+/CD8+TEM。(2)树突状细胞亚群。髓样树突状细胞(myeloid dendritic cells,mDC):Lin-CD45+DR+CD11c+CD123-;浆细胞样树突状细胞(plasmacytoid dendritic cells,pDC):Lin-CD45+DR+CD11c-CD123+;活化髓样树突状细胞(activated-myeloid dendritic cells,acti-mDC):CD40+mDC;活化浆细胞样树突状细胞(activated-plasmacytoid dendritic cells,acti-pDC):CD40+pDC。(3)B淋巴细胞亚群。初始B细胞(naive B cells,NBCs):CD45+CD19+CD27-;记忆B细胞(memory B cells,MBCs):CD45+CD19+CD27+;调节性B细胞(regulatory B cells,Breg):CD45+CD19+CD24+CD38+;浆母细胞(plamsablasts,PBs):CD45+CD19+CD27+CD38+。

1.6流式CBA法测定血清细胞因子水平 按要求混合捕获磁珠,离心后在血清增强缓冲液中重悬备用;同时复溶细胞因子标准品,依据1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、1∶512梯度在流式管中倍比稀释,并设置空白管;分别吸取50 μL的混合磁珠、PE检测试剂、样本/标准品于相应流式管中,室温避光反应3 h,加入1 mL洗涤缓冲液终止结合,离心吸弃上清液后再以300 μL洗涤缓冲液重悬磁珠,上机检测PE荧光强度。使用FCAP Array软件绘制标准曲线并计算各样本浓度。

2 结果

2.1治疗前后RA患者疾病活动度比较 与治疗前比较,RA患者经托珠单抗联合甲氨蝶呤治疗后DAS28评分由3.03±1.22下降至2.47±1.31(t=2.25,P=0.035),CRP由5.75(5.20,17.4)mg/L下降至5.30(5.18,6.13)mg/L(z=-2.454,P=0.014),差异均有统计学意义。

2.2治疗前后RA患者外周血T淋巴细胞亚群比例比较 结果表明,治疗后患者外周血中活化记忆T细胞比例显著降低(P<0.05),其中包括活化中央记忆CD4+T细胞(acti-CD4+TCM)、活化效应记忆CD4+T细胞(acti-CD4+TEM)、活化中央记忆CD8+T细胞(acti-CD8+TCM)、活化效应记忆CD8+T细胞(acti-CD8+TEM),流式结果见图1;但外周CD4+/CD8+初始T细胞(CD4+TN、CD8+TN)、调节性T细胞(Treg)、中央记忆T细胞(CD4+TCM、CD8+TCM)、效应记忆T细胞(CD4+TEM、CD8+TEM)较治疗前无明显变化(P>0.05),见表1。

图1 托珠单抗联合甲氨蝶呤治疗前后活化记忆T细胞比例变化

表1 治疗前后外周血T淋巴细胞亚群比例比较

2.3治疗前后外周血树突状细胞亚群及B淋巴细胞亚群比例比较 经托珠单抗联合甲氨蝶呤治疗后,患者外周血中髓样树突状细胞(mDC)比例明显减少,差异有统计学意义(P<0.05);其他树突状细胞亚群如浆细胞样树突状细胞(pDC)、活化浆细胞样树突状细胞(acti-pDC)、活化髓样树突状细胞(acti-mDC)差异均无统计学意义(P>0.05);B淋巴细胞各个亚群包括初始B细胞(NBCs)、记忆B细胞(MBCs)、调节性B细胞(Breg)和浆母细胞(PBs)差异均无统计学意义,见表2。

表2 治疗前后外周血B淋巴细胞亚群和树突状细胞比例比较(%,n=22)

2.4治疗前后血清细胞因子含量比较 经托珠单抗联合甲氨蝶呤治疗后,患者血清中IL-6水平明显降低,差异有统计学意义(P<0.05),而其他细胞因子如TNF-α、IL-10、IL-2均有一定程度的下降,但差异无统计学意义(P>0.05),见表3。

表3 治疗前后血清细胞因子含量比较[pg/mL,M(P25,P75),n=22]

3 讨论

RA作为一种常见的慢性自身免疫病,严重影响患者的生活质量。研究表明,RA发病受环境以及遗传等因素影响,虽然其具体机制尚未阐明,但免疫细胞、非免疫细胞(成骨细胞和破骨细胞)及其分泌的细胞因子在其发生发展中发挥重要作用[4]。RA产生的核心在于自身抗体类风湿因子(rheumatoid factor,RF)和抗环瓜氨酸肽抗体(anti-cyclic peptide containing citrulline,ACPA)的形成。RF和ACPA由B淋巴细胞分泌,与瓜氨酸化蛋白结合后经抗原提呈细胞(DC为主)递呈给T细胞,触发炎症因子TNF-α、IL-6、IL-2的产生,导致自身反应性T细胞增殖及炎症部位破骨细胞生成,从而造成软骨和关节损伤[5]。在此过程中,T淋巴细胞发挥主要作用。研究表明,人T细胞可分为幼稚T细胞(naive T cells,TN)、中央记忆细胞(central memory T cells,TCM)和效应记忆细胞(effector memory T cells,TEM),其中TEM细胞和TCM细胞在血液中循环并靶向次级淋巴组织,遇到抗原时可转换为活化的T细胞。尤其是TEM细胞,是RA中自身免疫记忆T细胞的主要类型,具有即时效应功能[6]。此外,T细胞亚群中的Treg细胞能够通过分泌的IL-10及表面免疫抑制分子,减弱抗原提呈细胞的抗原提呈功能,负向调节免疫反应,但该作用在RA中被抑制,B细胞亚群中的Breg细胞也具有类似的作用[7]。

鉴于RA复杂的细胞及细胞因子作用网络,近年来,靶向RA免疫细胞及细胞因子的生物制剂层出不穷,其中以靶向TNF-α的英夫利昔单抗和IL-6受体的托珠单抗临床应用最为广泛[8]。托珠单抗作为首个针对IL-6R的人源化单克隆抗体,可以通过静脉或皮下注射,抑制IL-6R介导的所有信号,单独或联合甲氨蝶呤治疗抗风湿药应答不足的成人中重度活动性RA[9]。

本研究结果发现,托珠单抗的治疗能够普遍减轻患者炎症,降低患者DAS28评分,且该作用主要是通过减少炎症因子和炎症细胞实现的,抑炎指标Treg、Breg、IL-10在此过程中没有变化。这说明托珠单抗与甲氨蝶呤联合治疗通过抑制过度活化的免疫应答而不是上调抑制性免疫应答发挥治疗作用。这从RA的发病机制上可以解释。研究证实,IL-6R介导的JAK-STAT信号通路通过促进B细胞活化和T细胞增殖,诱发或加重RA病变[10]。托珠单抗与甲氨蝶呤联合治疗可有效降低RA病人血清中IL-6的产生,从源头上减少IL-6R介导JAK-STAT信号通路的活化,从而减轻炎症反应。该治疗方案可以有效降低外周活化的自身反应性T细胞比例,即活化记忆T细胞,包括CD4+T细胞和CD8+T细胞,其中以CD4+T细胞的降低更为显著。此外,治疗后mDC的比例也明显减少。mDC主要发挥抗原提呈作用,mDC的减少可能意味自身抗原向记忆T细胞的提呈减少,进一步导致T细胞活化程度降低,有利于疾病好转。托珠单抗与甲氨蝶呤联合治疗对外周血中B淋巴细胞亚群的影响较小,这可能与B细胞分群不够精细有关,过去有研究表明托珠单抗治疗使IgD-CD27-记忆B细胞比例降低到正常水平,但不影响其他B细胞亚群[11]。同时在本研究中,更多女性患者接受托珠单抗联合甲氨蝶呤治疗;且相关文献表明性别对托珠单抗治疗效果没有影响,男女RA患者外周血中免疫细胞分布比例没有明显差异[12],因此认为在本研究中性别不影响结果的判断。

综上所述,托珠单抗延缓RA的进展更依赖于其对活化记忆T细胞和IL-6的抑制作用,而对B细胞亚群以及其他炎性因子的抑制作用不显著。这有助于临床针对患者进行个体化治疗,对于记忆T细胞过度活化和IL-6升高的患者,托珠单抗的使用则更加有效。