镜鲤野鲤碘泡虫病的诊断与组织病理损伤研究*

樊 威，贺 扬，卓 婷，罗 煜，焦晓磊，王 均，黄小丽，苏 建

(1.四川省内江市农业科学院，四川 内江 641000；2.四川农业大学 动物医学院，四川 成都 611130；3.内江师范学院 生命科学学院，长江上游鱼类资源保护与利用四川省重点实验室，四川 内江 641000；4.四川农业大学 动物科技学院，四川 成都 611130)

野鲤碘泡虫(Myxobolus koi)隶属于粘体动物门(Myxozoa)粘孢子纲(Myxosporidia)双壳目(Bivalvulida)碘泡科(Myxobolidae)碘泡虫属(Myxobolus)，是粘孢子虫中较常见的寄生虫，主要危害鲤科鱼类，在美洲、欧洲和亚洲等多个国家和地区均有报道。该寄生虫最早由日本科学家KUDO[1]于1920 年在鲤(Cyprinus carpio)上发现，之后陆续在锦鲤(C.carpio haematopterus)[2-3]和鲫(Cauratus auratus auratus) 上发现[4]。在中国，野鲤碘泡虫主要危害鲤与鲮 (Cirrhinus molitorella)，流行季节多为春、秋两季[5]。随着设施化养殖模式的发展，作为鲤科鱼类养殖过程中重要的碘泡虫疾病备受关注。

镜鲤(C.carpioL.)又名三花鲤鱼、三道鳞，属硬骨鱼纲 (Osteichthyes)鲤形目(Cypriniformes)鲤科(Cyprinidae)鲤属(Cyprinus)。镜鲤易患车轮虫、小瓜虫和粘孢子虫等多种寄生虫疾病，在集约化养殖中极易患粘孢子虫病[6-7]。李永生等[8]对粘孢子虫病的类型进行了分类，并对镜鲤感染野鲤碘泡虫的表观症状进行了描述，但并未涉及其病理损伤的相关研究。本研究从自然感染发病的镜鲤鳃组织处观察到乳白色赘生物，压片观察到寄生虫孢囊，并通过18S rRNA 基因序列分析和系统发育树构建对该寄生虫进行鉴定；进一步通过病理学观察确定该寄生虫对镜鲤鳃组织病理损伤。作为近年来首次对野鲤碘泡虫感染镜鲤进行的病理学研究，研究结果可为该病的诊断、防治以及致病机制的探讨提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验动物

患病镜鲤10 尾于2021 年6 月初采自四川成都金堂县某养殖场。发病时水温(25±2) ℃，发病率约70%，死亡率约20%。病鱼体长8～10 cm，体质量15～20 g，典型症状为鳃部出现大小不等的乳白色赘生物。送检时所有病鱼均存活。

1.2 试剂

组织基因组DNA 提取试剂盒和DNA 凝胶回收试剂盒均购自宝生物工程(大连)有限公司；Goldview 购自上海星科生物公司；琼脂糖购自百乐生物有限公司；ddH2O 购自天根生物有限公司；MS-222 购自默克公司。

1.3 尸检

送检鱼经MS-222 麻醉致死后进行尸检，依次检查鱼的体表、鳃、围心腔、肝胰腺、脾、肾和消化道等器官，观察有无异常，注意色泽和大小变化，对肉眼可见的损伤或特异性病灶进行拍照记录。

1.4 细菌学检查

用75%酒精对脏体表面消毒后，在无菌条件下使用接种环分别挑取适量脾和肾组织接种至BHI 培养基，25 ℃恒温培养1 周，观察细菌的生长情况。

1.5 寄生虫学检查

1.5.1 压片观察

去除病鱼鳃盖，取少量附着于鳃弓和鳃丝的赘生物置于载玻片上，在载玻片上滴加1 滴生理盐水，盖上盖玻片轻轻挤压组织，于光学显微镜下观察压片结果[9]。

1.5.2 寄生虫18S rRNA 基因序列测定与系统发育分析

参照组织基因组DNA 试剂盒说明书提取含赘生物的基因组DNA。以组织DNA 为模板，使用真核生物18S rRNA 基因的通用引物[10](上游引物：5＇-GCGGATCCGCGGCCGCTGGTTGATCCTGCCAGT-3＇，下游引物：5＇-GCGGATCCGCGGCCGCYGCAGGTTCACCTAC-3＇) 进行PCR 扩增。PCR 反应体系为：10×PCR Mix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，模版DNA 2.0 μL；PCR 反应条件为：94 ℃ 预变性5 min；94 ℃1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共40 个循环；72 ℃ 延伸10 min。PCR 产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，并经DNA 纯化试剂盒纯化后送至成都擎科梓熙生物技术有限公司测序。将测序序列上传至GenBank，并进行BLAST 分析核酸序列。选择与测序序列相关性较高的核酸序列，采用MEGA 6.0 软件进行比对，并采用邻接法(neighborjoining，NJ)构建系统发育树[11]。

1.6 组织病理学检查

分别取病鱼的鳃、皮肤肌肉、心、肝胰腺、肾、脾、脑、肠道、鳔和眼睛等组织，用10%中性福尔马林固定，经石蜡包埋处理后进行标准切片(3 μm)，HE 染色后用中性树胶封片，于光学显微镜下观察病理损伤并拍照记录。

2 结果与分析

2.1 剖解及镜检结果

病鱼鳃部严重溃烂，黏液增多，且鳃丝上有水霉寄生 (图1a) ；鳃丝 (图1b) 和鳃弓 (图1c) 上有大小不一的乳白色圆形赘生物。取赘生物压片观察发现：赘生物由大量粘孢子虫样孢子组成(图2a)，孢子壳面呈梨形，前端尖后端圆，并且前端有2 个大小相等的瓜子形极囊，约占孢子大小的2/3 (图2b) 。

图1 病鱼的临床特征Fig.1 Clinical features of diseased fish

图2 赘生物的显微镜观察Fig.2 Observation of neoplasm by microscope

2.2 18S rRNA 基因序列与系统发育分析

经PCR 扩增得到18S rRNA 基因，其片段大小为1 999 bp (登录号：KT240127) (图3)；BLAST分析结果显示：该序列与GenBank 中野鲤碘泡虫(登录号：FJ841887) 的18S rRNA 基因序列同源性最高 (99%)。筛选GenBank 中与KT240127 同源性在92%～97%范围内的19 个碘泡虫属18S rRNA 基因序列进行系统发育树构建，结果(图4)显示：该序列与野鲤碘泡虫 (登录号为FJ841887和KJ725077) 聚为一族。结合该病例的临床症状、孢子形态特征及基因序列与系统发育树结果确定该粘孢子虫为野鲤碘泡虫 (Myxobolus koi)。

图3 18S rRNA 基因PCR 扩增产物电泳结果Fig.3 PCR results of 18S rRNA

图4 18S rRNA 基因系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree of 18S rRNA

2.3 组织病理学观察

组织病理学观察显示：野鲤碘泡虫孢囊仅大量出现在鳃中，而未存在于皮肤、肌肉、心、肝胰腺、肾、脾、脑、肠道、鳔以及眼睛等组织中。野鲤碘泡虫孢囊在鳃组织中主要分布于鳃弓和鳃丝，孢囊外可见由大量鳃组织细胞、炎性细胞和成纤维细胞等共同形成的肉芽肿样壁，该部分将孢囊和鳃组织隔离开(图5 a～c)；孢囊内可见大量双极囊孢子和坏死的鳃组织细胞(图5 d)。孢囊排列致密，孢囊膜形成较多褶皱，大量营养体分布在孢囊壁周围(图5 e)。孢囊附近的鳃组织出现严重坏死性炎性反应，大量鳃组织细胞体积缩小、胞核浓缩，细胞坏死，孢囊周围可见大量嗜伊红粒细胞和巨噬细胞等炎性细胞(图5 f～h)。鳃坏死区域外围可见鳃小片出现严重增生现象，大量鳃小片变宽、增厚以及部分出现融合 (图5 c)。

图5 感染野鲤碘泡虫后镜鲤鳃的组织病理学观察Fig.5 Pathohistological observation of the gill ofCyprinus carpioL.infected withMyxobolus koi

3 讨论

碘泡科是粘孢子纲中粘孢子虫种类最多的科，也是对鱼类危害最严重的粘孢子虫类群之一，全球已发现超过900 种碘泡虫以鱼类为宿主[12]，中国已报道碘泡虫300 余种[13]，主要包括野鲤碘泡虫、圆形碘泡虫、洪湖碘泡虫和瓶囊碘泡虫等。本研究经尸检、显微镜检查和分子生物学检查后，确定引起镜鲤鳃部赘生物的病原为野鲤碘泡虫，本发现为中国近年来首次开展的野鲤碘泡虫感染镜鲤的病理研究。野鲤碘泡虫可危害多种水产品，但不同的鱼感染后其孢囊出现部位稍有差异。野鲤碘泡虫主要在稚鱼阶段寄生鲤科鱼类鳃部，鲤鱼感染野鲤碘泡虫后可在鳃丝和鳃弓上形成大小不等、形状各异的白色孢囊；而鲮感染后则可在鳃和体表形成大量由小孢囊融合而成的大孢囊[4,14]，表明野鲤碘泡虫有宿主特异性与组织趋向性。本研究在自然发病的镜鲤鳃丝和鳃弓上发现大量大小不等的白色点状孢囊；但体表和体内其他器官组织未见孢囊，与耿毅等[15]对鲤鱼感染的报道一致，这可能与鳃是鱼体对外接触频率最高的黏膜组织有关。HIROSHI 等[16]发现：野鲤碘泡虫有小孢囊型和大孢囊型2 种寄生类型，分别寄生于鳃小片和鳃丝中。柳阳[17]对鲤鱼的研究发现：寄生于鳃小片的野鲤碘泡虫孢囊可阻碍鳃小片的血液流动，造成血细胞淤积于孢囊一端；但本研究中鲤碘泡虫孢囊仅寄生于鳃丝，未在鳃小片观察到有寄生现象，因此，推测本研究中野鲤碘泡虫的感染模式为大孢囊型感染。

组织病理学观察发现：寄生于鳃丝结缔组织间的野鲤碘泡虫孢囊由增生的表皮细胞包裹，形状不规则，孢囊膜形成较多褶皱，这可能与孢囊体积增大造成的挤压有关；孢囊里的孢子较密集，分散在孢囊颗粒里，这与华鼎可[14]的报道基本一致。HEDRICK 等[18]认为嗜酸性粒细胞可能参与了细胞免疫应答，本研究也在孢囊周围发现了大量嗜酸性粒细胞和巨噬细胞等炎性细胞。根据组织病理学结果推测：寄生于鳃组织的孢囊刺激鳃分泌更多黏液，同时分解细胞获得生长所需的营养物质，继而不断分裂繁殖扩张挤压鳃部，使鳃组织结构受损，鳃丝或变形或断裂。此外，鳃损伤继发了水霉感染，进一步造成鱼体呼吸障碍，最终病鱼因呼吸困难和营养不良而死亡。

普遍认为碘泡虫的生活史包括无脊椎动物宿主和脊椎动物宿主2 个阶段。无脊椎动物宿主通常为环节动物，该阶段碘泡虫形态差异较大，被称为三突放射孢子虫，当成熟的三突放射孢子与鱼体黏膜表面接触后，促使孢原质通过极囊阀与黏膜分泌孔相连的极丝管道输入鱼体，完成感染的最初步骤[19]，随后感染鱼体的孢原质沿着神经纤维移行至寄生靶点，逐步繁殖并发育并形成孢囊；脊椎动物宿主为鱼类，该阶段碘泡虫外壳变得坚硬，形态变化较小，被称为对称孢子虫，成熟的对称孢子虫脱落后可利用宿主黏膜组织入侵机体，寄生于鳃、肠道和皮肤等主要黏膜组织[20]，进入下一个寄生循环。野鲤碘泡虫的孢囊壁外包裹着较厚的结缔组织和1 层表皮细胞，孢囊内孢子的孢壳层由原生质特化而成，结构精密，药物很难进入，因此野鲤碘泡虫病具有顽固的抗药性。要取得较理想的防治效果，需根据野鲤碘泡虫生活史中的2 个薄弱环节采取综合生态措施：一是孢子生殖阶段，该阶段主要生活在环节动物体内[21]，故可通过清除底泥进行预防以及使用水体杀虫剂进行杀灭[22]；二是裂体生殖期的营养体时期，裂体生殖期感染鱼体后，先形成营养体，通过发育才形成孢子和孢囊[21]，营养体是一个没有壳片的变形体，较容易死亡，所以是内服杀灭的重点。KISMIYATI 等[23]研究发现：对金鱼进行粗孢子蛋白免疫后，其体内白细胞计数显著增加，可将野鲤碘泡虫感染的成活率从20.00%提高至86.37%。因此，以碘泡虫粗孢子蛋白为材料制作的亚单位疫苗有望作为预防碘泡虫病的手段之一。

4 结论

本研究基于寄生虫的形态学与分子生物学数据以及宿主信息，结合实验室诊断和组织病理学观察，确诊本次感染的病原为野鲤碘泡虫。研究结果补充了野鲤碘泡虫感染鲤科鱼类的典型症状和病理特征，初探了中国野鲤碘泡虫感染镜鲤的寄生类型和病理损伤机制，为该病的诊断和致病机制研究提供了理论支撑。