烘烤期烟叶霉烂病生防菌株的筛选与应用

尚海丽,杨发祥,,华小兵,郭山虎,赵崇钧,盘文政,*,李 诚,赵学通,张 琪,肖勇飞,朱永立,张志红,李荣海

(1.云南省微生物发酵工程研究中心有限公司,云南 昆明 650217;2.云南云叶化肥股份有限公司,云南 昆明 650217;3.湖南中烟工业有限责任公司,湖南 长沙 410014)

0 引言

【研究意义】烟叶烘烤过程中常发生烤青烟、蒸片烟、黑糟烟、挂灰烟及烟叶霉烂等“烤坏烟”,对烟叶生产和烟农造成重大损失[1-3]。其中,烟叶霉烂是由于烟叶烘烤过程中变黄期温度过低、相对湿度过高,烟叶受病原微生物侵染引起的潜在病害,极大降低烟叶的使用价值[4-5]。因此,开展霉烂病研究,开发有效的防治措施,对减少烟农损失、提高烟叶质量具有重要的现实意义。【前人研究进展】长期以来,由病原物引起的烟叶霉烂病及其造成的损失未引起人们足够的重视,常常被认为是“烘烤不当”所造成的[5]。目前,关于烘烤期间烟叶霉烂病防治措施的研究主要集中在优化烘烤工艺、喷施药剂和熏蒸灭菌等方面。针对变黄期低温高湿的状况,丁海龙[6]研究提出稀装烟、提前排湿及稳转火等技术措施以控制烟叶霉烂病;黄宁等[7]探索出点火后快速升温、缩短变黄期及降低湿度等技术措施避免烟叶的霉变;苏家恩等[8]对比不同抗微生物制剂对烤后烟叶霉烂病的防控效果表明,天然抗微生物制剂防控效果优于化学合成抗微生物制剂,天然抗微生物制剂中0.2%纳他霉素防控效果最好,达87.99%。王永栋等[9]提出,在严格控制装烟密度的前提条件下,烤前、烤中采用二氧化氯熏蒸消毒,对霉烂病的总体防治效果达62.62%～69.57%。已有研究指出,在烟叶上添加优势微生物,对烟叶中的霉菌有明显抑制作用,可用于仓储过程中烟叶霉变的防治[10]。经过近几年的持续研究,逐步明确各省主要烟区烘烤期烟叶霉烂的主要病原菌是米根霉(Rhizopusoryzae)[11-13]。【研究切入点】上述技术措施防控烟叶霉烂病均有一定的局限性,通过快速升温降低湿度控制霉烂病发生的方法,需解决变黄期缩短与烤后烟叶质量之间的矛盾;化学药剂消毒存在安全风险;采用二氧化氯熏蒸消毒,在鲜烟叶带菌的情况下防效不理想。生防菌具有繁殖快速、安全无毒、抑菌杀菌等特点,因此,筛选出烘烤过程中对烟叶霉烂病具有较好防控效果的生防菌,有利于科学防控烟叶霉烂病及保障烟叶质量安全。【拟解决的关键问题】根据以菌治菌的原理,采用共培养的方法筛选对米根霉具有明显抑制作用的生防菌株,并结合室内和田间应用研究其防治效果,以期探明烘烤期烟叶霉烂病生防功能菌株的种类及其防治效果,为高效、安全防治烟叶霉烂病,降低烘烤损失,增加烟农收入,提高烟叶安全性提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试生防菌 15株生防菌均为耐热芽孢杆菌,保存于云南省微生物发酵工程研究中心有限公司菌种库。

1.1.2 供试病原菌 烟叶霉烂病病原菌米根霉,课题组前期从云南省楚雄州武定县白路镇发生霉烂病的烟叶中分离、纯化获得,保存于云南省微生物发酵工程研究中心有限公司菌种库。

1.1.3 供试健康烟叶 烟叶样品(含叶柄)采自云南省楚雄州武定县白路镇平地村,烤烟品种为云烟87。

1.2 方法

1.2.1 生防菌筛选 用无菌挑针挑取供试生防菌菌株,划线接种于新鲜LB平板内,置于37℃恒温培养箱内黑暗培养3 d。制备浓度为105cfu/mL的米根霉孢子悬浮液,并取100 μL孢子液涂布于PSA平板,置于32℃培养箱内黑暗培养5 h;然后取出平板,用无菌挑针分别挑取活化的15株生防菌单菌落分别接种于PSA平板上,置于32℃培养箱内黑暗培养;2 d后观察平板内细菌的生长情况及是否出现抑菌圈。每个处理3次重复。

1.2.2 生物防治

1) 室内。用自来水和无菌水依次冲洗田间采集的烟柄3次,并在70%酒精中浸泡30 s后用无菌水冲洗3遍,放在超净工作台内自然风干(下同)。选取抑菌效果最好的菌株制备104cfu/mL的米根霉孢子悬浮液,均匀喷施在烟柄表面,待自然风干后分别置于浓度为107cfu/mL(A1)、106cfu/mL(A2)和105cfu/mL(A3)的生防菌液内浸泡10 min后取出,再次自然风干后转入50 mL无菌烧杯内,用保鲜膜封口,再用挑针在其上扎20个小孔后置于37℃培养箱内黑暗保湿培养。每天观察菌落生长动态,4 d后记录各处理烟柄的发病情况。每个处理10个烟柄,3次重复。以用无菌水浸泡的烟柄作为对照(CK)。结合常规叶面病害统计方式设病情分级标准:0级,未感染;1级,发病面积占总面积的5%以下;3级,发病面积为5%～25%;5级,发病面积为25%～50%;7级,发病面积为50%～75%;9级,发病面积占总面积的75%以上。计算病情指数,发病率和相对防治效果。

发病率=发病样本数/总样本数×100%

病情指数=[∑(各级样本数×相应级数)/(总样本数×9)]×100

相对防治效果=[(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数]×100%

2) 田间。在云南省楚雄州武定县随机选取一个自然发病烤房进行田间防治试验。试验烤房为普通气流上升式4层密集式烤房,装烟室规格为8.0 m×2.7 m×4.1 m,装烟层距地面高度分别为1.2 m、2.0 m、2.8 m和3.6 m。制备活菌数为1.5×106cfu/mL、7.5×105cfu/mL及1.5×105cfu/mL生防菌液备用。采用浸泡叶柄和喷淋叶柄2种方式进行烟叶霉烂病防治:第1种为浸泡叶柄,将田间采集的新鲜烟叶基部(40～50 cm)分别在不同浓度生防菌液中浸泡10 min后取出,然后将烟叶在阴凉处晾干后按常规烘烤方式烘烤;第2种为喷淋叶柄,将不同浓度的生防菌液在烤烟烘烤前进行叶柄喷淋,喷淋完成后将烟叶在阴凉处晾干,然后按常规方式烘烤。以常规作对照,即不施用生防菌液,按照常规采烤方法进行烘烤。田间试验方案设置见表1。每个处理3次重复,每个重复100片烟叶,随机排列挂牌标记。初烤结束后,参考王永栋[12]的方法记录发病情况,并计算病情指数、发病率和相对防效。烟叶霉烂病病情等级划分:0级,正常烟叶;1级,烟秆发霉小于1 cm,叶片不发病;2级,烟秆发霉大于1 cm,叶片不发病;3级,烟秆发霉,且叶片发霉面积达1%～25%;4级,烟秆发霉,且叶片发霉面积达26%～50%;5级,烟秆发霉,且叶片发霉面积达50%以上。

发病率=发病叶数/调查总叶数×100%

病情指数=[∑(各级病叶数×相应级数)/(调查总叶数×5)]×100

相对防治效果=[(对照组病情指数-处理组病情指数)/对照组病情指数]×100%

表1 田间试验处理设置Table 1 Treatment design for the field test

1.3 数据统计与分析

采用Excel 2016整理相关数据,采用SPSS 22.0进行单因素方差分析,各处理间采用Duncan's新复极差法进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 生防菌株的抑制效果

从表2看出,15株生防菌对米根霉的抑菌圈直径为0.00～3.03 cm,其中,有4株菌株对米根霉有拮抗作用,其分别是解淀粉芽孢杆菌YWF-17-0001和YWF-17-0006、胶质芽孢杆菌YWF-17-0005及枯草芽孢杆菌YWF-17-0011,其抑菌圈直径为0.94～3.03 cm,依次为YWF-17-0001>YWF-17-0011>YWF-17-0005>YWF-17-0006,以解淀粉芽孢杆菌YWF-17-0001对米根霉的抑菌效果最好,抑菌圈直径达3.03 cm,显著高于菌株YWF-17-0006和YWF-17-0005,与菌株YWF-17-0011差异不显著,其余菌株间差异不显著。解淀粉芽孢杆菌YWF-17-0001可作为备选菌株进行后续研究。

表2 不同生防菌株对米根霉的抑制效果Table 2 Inhibition effect of different biocontrol strains against R. oryzae

2.2 生防菌株对米根霉的防治效果

2.2.1 室内防效 观察发现,在接种培养2 d后,对照(CK)烟叶的烟柄表面长出微量白色菌丝;随培养时间的推移,霉烂病的发病情况不断加重。各处理(A1～A3)较对照晚1 d左右发病,且米根霉的感染率大幅降低;4 d后,各处理的产孢量较对照明显减少。从表3看出,A1～A3烟叶的发病率为0.00%～23.22%,病情指数为0.00～2.59,均表现为A3>A2>A1,且均显著低于CK(80.00%,53.33),A1显著低于A3和A2,A2与A3差异不显著。A1～A3的相对防治效果为95.14%～100.00%,表现为A1>A2>A3,即随解淀粉芽孢杆菌YWF-17-0001处理浓度降低,对米根霉的室内防治效果呈下降趋势,当浓度为105cfu/mL时(A3)防治效果最差;当浓度达107cfu/mL时(A1),烟柄未出现霉变现象,防治效果达100.00%。表明,较低浓度的解淀粉芽孢杆菌YWF-17-0001菌液对米根霉有较好的防治效果。

表3 解淀粉芽孢杆菌YWF-17-0001对米根霉的室内防治效果Table 3 Indoor control effect of strain YWF-17-0001(B. amyloliquefaciens) against R. oryzae

2.2.2 田间防效 从表4看出,解淀粉芽孢杆菌YWF-17-0001各处理浓度对烟叶霉烂病均有较好的防治效果。发病率:随处理浓度下降烟叶发病率呈上升趋势,各处理的发病率为0.33%～5.00%,表现为T6>T5>T4>T3>T2>T1,其中,T1～T6烟叶的发病率均显著低于对照(50.00%),T1～T3烟叶的发病率差异不显著,但均显著低于T4～T6,T4～T6差异不显著。病情指数:随处理浓度下降烟叶的病情指数呈上升趋势,各处理的病情指数为0.04～0.38,表现为T6>T5>T3>T4>T2>T1,其中,T1～T6烟叶的病情指数差异均不显著,但均显著低于对照(21.11)。相对防治效果:各处理浓度的相对防治效果为98.20%～99.81%,表现为T1>T2>T4>T3>T5>T6,各处理间抑制作用差别较小,表明,用1.5×105cfu/mL的菌液浸泡或喷施烟柄,防治效果均超过98.00%。说明,在烟叶烘烤前,喷施或浸泡解淀粉芽孢杆菌YWF-17-0001菌液能够有效防控烘烤期的烟草霉烂病。

表4 解淀粉芽孢杆菌YWF-17-0001对米根霉的田间防治效果 Table 4 Control effect of strain YWF-17-0001 (B. amyloliquefaciens) against R. oryzae in field

3 讨论

烘烤期烟叶霉烂病的发生严重影响烟叶品质和经济效益,如何进行控病减损,绿色、安全、高效地减少霉烂病的发生,也越来越得到行业的重视[14]。烟叶烘烤过程中霉菌污染主要发生在叶片变黄期,烤房内温度36～40℃、相对湿度75%～85%时最有利于米根霉的生长[15]。利用微生物防控的原理,从变黄期的特定温湿度条件出发,有针对性地筛选抗病、耐热且易于定殖的微生物[16],并进行开发利用,结合烘烤工艺流程的微调整,从而实现烟叶霉烂病的生物防治,既满足人们对绿色食品的需要,又符合农业可持续发展的需求。解淀粉芽孢杆菌[17]、枯草芽孢杆菌[18]、胶质芽孢杆菌[19]及贝莱斯芽孢杆菌[20]等对烟叶霉变菌具有较强的拮抗作用。本研究从15株生防菌株中筛选出4株能明显抑制烟叶霉烂病病原菌米根霉生长的菌株,包括解淀粉芽孢杆菌YWF-17-0001和YWF-17-0006、胶质芽孢杆菌YWF-17-0005及枯草芽孢杆菌YWF-17-0011,其抑菌圈直径为0.94～3.03 cm,其中,解淀粉芽孢杆菌YWF-17-0001的抑菌效果最好,室内喷施浓度为105cfu/mL及以上时对烟草霉烂病的防效达95%以上;烟叶烘烤前用YWF-17-0001菌液1.5×105～1.5×106cfu/mL喷施或浸泡烟柄,对烟叶霉烂病的防治效果达98%以上。赵文姬[17]研究也表明,解淀粉芽孢杆菌对烟叶霉变菌具有较强的抑制作用。解淀粉芽孢杆菌属革兰氏阳性菌,具备产生多种酶类和抗菌活性物质的能力,能够促进生物膜形成,定殖在植物体内,与植物形成共生关系,促进植物生长,并对多种植物病原菌形成抑制作用[21];应用在烟叶烘烤过程中无毒无害,不会对烟叶品质产生不利影响,是一种绿色、安全且高效的烟叶霉烂病生物防控制剂。

烟叶烘烤过程中霉烂病对烟叶质量影响较大,采用以菌治菌是目前烟叶霉烂病防治较为绿色环保的方法,本试验取得了初步的研究成果,但要推广应用,菌株YWF-17-0001发酵底物筛选、发酵工艺优化及田间应用技术等有待进一步试验,其对烟叶品质的影响也有待进一步研究。

4 结论

从15株耐热芽孢杆菌中筛选出1株能够明显抑制米根霉生长的生防拮抗菌——解淀粉芽孢杆菌YWF-17-0001,其室内和田间对烟叶霉烂病的防效均达95%以上。解淀粉芽孢杆菌YWF-17-0001具有拮抗烟叶霉烂病病原菌的能力,可作为一种烟草霉烂病生物防控候选菌株进一步深入研究。