外泌体在多囊卵巢综合征中的研究进展

陈雯, 连方, 辛欣, 于辰, 梁启惠, 吴海萃

(1. 山东中医药大学第一临床医学院,山东 济南 250011; 2. 山东中医药大学附属医院生殖与遗传科,山东 济南 250014)

多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)是一种常见的女性内分泌疾病,其临床症状具有高度异质性,以月经不调、高雄激素血症、代谢异常、生殖障碍为主要临床表现。研究表明,PCOS患者患有2型糖尿病、心血管疾病、子宫内膜癌等疾病的概率大大增加,PCOS发病机制与排卵障碍、高雄激素血症、胰岛素抵抗、肥胖等因素综合作用相关[1]。外泌体作为天然的通讯分子,是细胞分泌的一种细胞外囊泡,外泌体及其内容物是细胞间信号传递的重要载体。近年来,随着外泌体研究领域的深入,大量研究表明外泌体及其内含物在包括PCOS在内的多种生殖、内分泌及代谢疾病的发生发展过程中发挥重要作用[2]。目前PCOS外泌体的研究主要集中在卵泡发育、内分泌及代谢异常、炎症反应等方面。本文主要阐述外泌体在PCOS中的作用及治疗价值,探讨外泌体在PCOS中的发生发展机制。

1 外泌体概述

外泌体是一种几乎可由所有细胞分泌的纳米级膜性囊泡,直径为30～150 nm,其主要成分包括表面磷脂双分子层及其携带的内容物(核酸、蛋白质、脂质、氨基酸和代谢物等)。外泌体包含的特异性生物分子决定了外泌体的功能,在癌症、代谢性疾病、心脑血管疾病以及神经退行性疾病等多个领域,主要发挥调控细胞间信息传递、免疫反应以及修复调节作用[3],尤其在介导癌症的进展与转移、早期诊断和治疗方面的研究更深入。Giovannelli等[4]研究报道,前列腺癌细胞通过释放外泌体直接作用于基质或前列腺癌上皮细胞,进行细胞交流。Wortzel等[5]研究发现,存在于原发性肿瘤细胞和远处器官微环境之间的外泌体通过介导细胞间通讯,在促进转移前局部肿瘤微环境(转移生态位)的形成和肿瘤转移方面发挥重要作用。Li等[6]研究显示,在免疫完整小鼠中传递肿瘤细胞来源的外泌体miR-155-5p可抑制卵巢癌的进展和巨噬细胞的浸润,并激活CD8+T细胞功能,产生免疫反应。此外,受细胞来源以及内容物的影响,外泌体的功能具有高度异质性,其中间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)来源的外泌体已被认为是一种新的组织损伤治疗方法,在血管生成、组织修复与再生、免疫调节、抵抗炎症方面发挥重要作用[7]。

基于独特的生物相容性、较好的稳定性和对细胞的高亲和力,外泌体被视为化学药物、RNA以及蛋白质等药物分子的最佳载体[8],在防止运载的药物分子分解、靶向受体细胞、提高药物利用率方面发挥优势作用。据Lou等[9]报道,miR-199a-3p修饰的脂肪来源的间充质干细胞(adipose derived mesenchymal stem cells,AMSC)外泌体可以通过靶向雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)通路提高肝细胞癌细胞对化疗药物的敏感性,一定程度上解决了体内miR-199a-3p分子直接给药易降解的问题。Kamerkar等[10]研究证实,基因工程改造后的外泌体,携带特异性靶向致癌基因KrasG12D的RNA,能够促进胰腺癌中致癌基因KRAS的靶向治疗作用,在多种胰腺癌小鼠模型中表现出良好的疗效。

2 外泌体在PCOS发生发展中的作用

基于脂质双分子结构、丰富的内容物以及穿梭于细胞的能力,外泌体在包括生殖、配子发生、胚胎发生和分化在内的各种生理和病理过程中发挥重要作用[11]。外泌体几乎可以由所有种类的细胞分泌到细胞外环境中,并已在PCOS患者体液中检测到。然而外泌体来源细胞及其携带的生物活性分子决定了外泌体功能的异质性。2019年Wang等[12]对卵泡液来源的外泌体进行生物信息学分析,发现有167个上调的环状RNA(circRNA)和245个下调的circRNA,可能靶向与细菌感染、慢性炎症和氧化应激相关的途径,并构建了circRNA-miRNA相互作用网络。2020年Wang等[13]通过高通量测序技术在PCOS患者的卵泡液中鉴定出1253个上调的长链非编码RNA(lncRNA)和613个下调的lncRNA,可能参与胞吞、河马信号通路、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路和人类T淋巴细胞白血病病毒Ⅰ型(human T-cell lymphotropic virus types Ⅰ,HTLV-1)感染相关的途径,其中CRK、CDC25B、AKT2、ELK4和TGFBR1基因以高富集分数显示其与MAPK信号通路的可能联系。Zhou等[14]通过微列阵分析卵泡液外泌体,构建了lncRNA、miRNA和6个PCOS相关基因(IRS1、CYP11A1、BMP6、FSHR、WNT4和CYP19A1)的调控网络,与Wang等[13]的研究结果一致,其中差异表达的RNA主要作用于MAPK信号通路和一些炎症相关信号通路。已有研究表明[15],MAPK信号通路协调细胞增殖、分化、生长及凋亡过程,在调控卵泡发育中起重要作用,这正是PCOS的主要发病机制之一。最近Bai等[16]基于卵泡液外泌体中lncRNA和颗粒细胞中miRNA、信使RNA(mRNA)构建了外泌体lncRNA驱动的PCOS的内源竞争RNA(ceRNA)网络,该网络显示主要富集于肿瘤坏死因子信号通路、过氧化物酶体增殖激活受体信号通路、脂肪酸代谢和昼夜节律等。

在PCOS患者血浆外泌体的研究中,Jiang等[17]发现了5种差异表达的miRNA,包括miR-126-3p、miR-146a-5p、miR-20b-5p、miR-106a-5p和miR-18a-3p,与月经周期、窦卵泡计数和激素水平相关。Zhang等[18]报道,PCOS患者血清外泌体中miR-1299、miR-6818-5p、miR-192-5p和miR-145-5p显著差异表达,并将这些miRNA鉴定为潜在的生物标志物。近期王宏锋等[19]首次从血浆外泌体角度研究PCOS相关的差异蛋白质组,筛选出16个PCOS相关的差异蛋白,包括4个表达上调和12个表达下调的蛋白,其中妊娠带蛋白(PZP)和甘露糖结合凝集素2(MBL2)有可能成为研究PCOS的新靶点。这表明PCOS中外泌体的差异性表达不是偶然现象,外泌体及其内容物可能在驱动PCOS发病机制中发挥一定的作用。

2.1 卵泡液外泌体调控卵巢颗粒细胞及卵丘细胞影响卵泡发育

尽管PCOS的病因和发病机制尚不明确,但卵泡发育异常诱导无排卵是PCOS的基本特征。卵泡液为卵泡发育和卵母细胞成熟提供重要的微环境。Hu等[20]研究表明,PCOS患者与对照组卵泡液外泌体内容物的表达存在显著差异,可能主要参与甘氨酸、丝氨酸和糖胺聚糖的生物合成以及苏氨酸代谢过程。近期的几项研究提示[21-25],卵泡液外泌体可能通过调控卵巢颗粒细胞和卵丘细胞影响卵泡发育。卵巢颗粒细胞是构成卵泡的重要组分,为卵子提供营养和传递信息,是卵泡发育的关键。Li等[21]发现PCOS中卵泡液外泌体蛋白质组学特征的改变,与炎症过程、活性氧代谢过程、细胞迁移和增殖有关,并且证明富含S100钙结合蛋白A9(S100-A9)的外泌体通过激活核因子κB(NF-κB)信号传导途径,显著加重炎症并破坏类固醇生成,在卵巢颗粒细胞功能的调节中起重要作用。Yuan等[22]研究发现,miR-424-5p在PCOS患者卵泡液外泌体中差异性表达且通过阻断细胞分裂周期相关蛋白4(cell division cycle associated 4,CDCA4)介导的Rb/E2F1信号通路,抑制卵巢颗粒细胞增殖并诱导卵巢颗粒细胞衰老。Zhao等[23]报道PCOS中卵泡液外泌体miR-143-3p通过靶向人骨形态发生蛋白受体-1A(recombinant bone morphogenetic protein receptor 1A,BMPR1A)并阻断Smad1/5/8信号通路,促进卵巢颗粒细胞凋亡。因此,PCOS中卵泡液外泌体miRNA通过影响卵巢颗粒细胞的生物学功能,可能在PCOS卵泡发育中发挥重要作用。在卵泡发育早期,卵母细胞与周围卵丘细胞表现出相互依赖的关系,其中卵丘细胞主要负责分泌生长激素和卵巢类固醇激素,在卵母细胞发育中起重要作用。Zhao等[24]研究表明,MSC衍生的外泌体miR-323-3p通过靶向PCOS中的程序性细胞死亡蛋白4(programmed cell death 4, PDCD4)促进细胞增殖并抑制卵丘细胞凋亡。此外,Wang等[25]研究证实在PCOS患者卵丘细胞中miR-323-3p的表达水平下调,其中下调的miR-323-3p通过靶向胰岛素样生长因子1调节PCOS中的类固醇生成和细胞凋亡,miR-323-3p可能是改善PCOS中卵丘细胞功能障碍的一个新的、有前途的分子靶点。因此,卵泡液来源的外泌体极有可能作为调控卵泡发育的新分子参与到PCOS的发生发展中。

2.2 外泌体介导细胞色素P450酶合成影响激素水平

高雄激素血症是PCOS的主要临床症状,表现为肥胖、多毛和脱发等。细胞色素P450酶包括CYP17、CYP21、CYP19和CYP11A,是类固醇激素生物合成途径中的关键酶。Chaudhary等[26]对PCOS患者卵巢膜细胞的研究表明,卵巢类固醇生成增加,雄激素产生增加,主要归因于类固醇激素生物合成途径中关键酶细胞色素P450酶的表达改变,其中CYP11A基因作为可能的遗传生物标志物在PCOS的发病机制中起主要作用。Yu等[27]报道了PCOS患者卵泡液外泌体中参与类固醇合成途径的核心酶mRNA水平,其中CYP11A、CYP19A和HSD17B2表达水平增加,同时伴随着卵泡液中激素水平的变化,PCOS患者卵泡液中雌三醇(P<0.01)、雌二醇(P<0.05)和异戊烯醇酮(P<0.01)水平显著升高,孕酮水平降低(P<0.05),这表明外泌体中mRNA的表达与卵泡液中激素水平的改变相关,卵泡液中差异表达的mRNA诱导类固醇生成异常,是PCOS患者卵泡液中雌激素和孕烯醇酮升高的潜在机制。然而由于研究者没有对卵泡液中的类固醇进行全面分析,故其表达水平与雄激素之间的关系还需进一步研究。Huang等[28]研究揭示了PCOS中卵泡液外泌体circLDLR的ceRNA网络,circLDLR的减少能够增加miR-1294的表达,抑制受体细胞中CYP19A1的表达,并减少其雌激素的分泌。目前有关PCOS外泌体与高雄激素血症的研究并不多,未来仍需在不同的队列中进一步研究。

2.3 外泌体调控胰岛素通路和肝脏代谢影响胰岛素抵抗

胰岛素抵抗在PCOS患者中普遍存在,且与其生殖和代谢并发症密切相关。Sun等[29]研究表明,人体MSC衍生的外泌体可以通过逆转外周胰岛素抵抗和减轻β细胞破坏来缓解2型糖尿病。肝脏是提供免疫和代谢功能的最大代谢器官,其中肝脏异位脂质积累作为可能影响PCOS代谢综合征的因素之一受到关注[30]。尽管近年对肝脏脂肪沉积与肝胰岛素抵抗之间的因果关系争论较多,但两者的相关性毋庸置疑。Gao等[31]对PCOS不同年龄阶段小鼠肝组织与肝外泌体进行研究,显示肝组织与外泌体之间的复杂代谢作用,其中糖酵解和三羧酸循环的下调可能与PCOS的肝脏病理生理机制有关,与年龄无关。在脱氢表雄酮诱导的PCOS大鼠模型中,Cao等[32]报道了AMSC及其衍生的外泌体可以部分由miR-21-5p介导,通过靶向B细胞易位基因2(B cell translocation gene 2,BTG2)调节肝脏葡萄糖稳态,显著减轻PCOS大鼠中包括代谢异常、多囊卵巢和不孕的多种表型。Ye等[33]对PCOS患者外泌体进行转录组学和代谢组学联合分析,发现β-生育酚、1-甲基乙内酰脲、2-异丙基苹果酸、全反式-4-羟基维甲酸和亚麻酸这5种差异代谢物可能参与PCOS的发病机制;而miRNA测序结果显示,差异miRNA主要调节代谢途径,因此推测miR-196a-3p,miR-143-5p,miR-106a-3p,miR-34a-5p和miR-20a-5p可能调节这5个差异代谢物,并且是诊断PCOS的潜在生物标志物。以上研究表明,外泌体可以通过调节基因表达来调节器官间外周组织包括肝脏以及脂肪组织的代谢过程,从而影响胰岛素抵抗,进而介导PCOS的发生发展。

2.4 外泌体调控糖脂代谢影响肥胖

PCOS通常与肥胖有关,损害生殖健康,高糖高脂肪饮食是导致肥胖的原因之一。给予来曲唑诱导PCOS小鼠高脂肪、高糖饮食一段时间后,治疗组小鼠和对照组小鼠均出现严重的代谢失调和生殖障碍[34]。脂肪组织过度堆积是肥胖最突出的特征,Zhou等[35]报道在排除食物摄入影响下,年轻健康小鼠棕色脂肪组织来源的外泌体可减轻高脂饮食诱导肥胖小鼠的体重、降低血糖并减轻脂质积累等代谢综合征。Hong等[36]研究表明,在具有胰岛素抵抗的PCOS小鼠模型中,血清外泌体中miR-20b-5p和miR-106a-5p的过表达可以减轻脂肪细胞分化,从而减轻胰岛素抵抗引起的PCOS发病过程中的脂质代谢障碍。据Katayama等[37]报道,miR-20b-5p可以通过蛋白激酶B(Akt)信号通路传导调节胰岛素刺激的葡萄糖代谢从而发挥细胞内作用,不仅被认为是与2型糖尿病相关的生物标志物,而且是调控糖脂代谢的新分子。综上,外泌体通过介导糖脂代谢过程影响肥胖,初步揭示了外泌体在调控PCOS脂质代谢障碍中的重要作用。

3 外泌体在PCOS中的治疗价值

鉴于PCOS临床症状的高度异质性,目前其治疗方案需要依据患者的需要个体化制订,除了改善生活方式和减重之外,药物治疗也以症状为导向进行针对性用药,尚没有特效药发挥显著治疗效果。基于外泌体载药的优势及其功能特点,外泌体及其差异表达的内容物已经在治疗PCOS卵泡发育、代谢异常以及缓解炎症方面发挥优势作用。Zhou等[38]的研究证明由卵泡液衍生的外泌体产生的miR-18b-5p可降低磷酸酯酶与张力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog,PTEN)的表达并促进磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/Akt/mTOR信号通路的激活,从而改善PCOS。Cao等[39]报道卵泡液来源的外泌体miR-143-3p/miR-155-5p可以通过调节PCOS中卵巢颗粒细胞的糖酵解来调节卵泡发育不良。此外,特别是MSC衍生的外泌体,作为一种治疗PCOS引起的不孕症的新方法,越来越受到关注。Zhao等[40]报道了人脐带MSC衍生的外泌体可以抑制PCOS中的NF-κB信号传导,从而减少卵巢颗粒细胞的炎症反应,并增加抗炎因子IL-10的表达。同时,它们还能抑制促炎因子肿瘤坏死因子-α和干扰素-γ的表达,发挥抑制细胞凋亡和促进孕酮生成的作用。

本文总结了近年来外泌体在PCOS中的研究,对PCOS外泌体差异表达的分子及其功能(表1)和外泌体对PCOS的治疗作用(表2)进行归纳。

表1 PCOS外泌体中差异表达的分子及其功能

表2 外泌体对PCOS的治疗作用

4 小结与展望

携带多种分子的外泌体作为细胞间交流的重要载体,通过介导卵泡发育、调节激素水平、胰岛素抵抗、肥胖与代谢障碍,参与PCOS的发生发展过程。通过对外泌体的蛋白质或核酸谱的变化进行分析,选取其特异表达的分子作为PCOS诊断和预后的生物标志物,有望成为PCOS早期诊断和治疗监测的新方式。此外,依据细胞来源研究外泌体及其内容物的治疗作用,对外泌体作用于PCOS的相关因子、作用通路进行分析,有助于进一步探索PCOS的发病机制,辅之以生物工程技术对外泌体进行改造,外泌体有望作为载体运送化学药物、RNA、蛋白质,未来可能实现对PCOS的靶向治疗,从而缓解PCOS患者内分泌以及代谢异常,达到治疗PCOS引起的不孕症的目的。然而外泌体的研究尚处于起步阶段,大规模生产和储存存在困难,目前尚没有用于外泌体分离和分析的标准化方法,但相信随着外泌体生物工程研究的深入,以及各种新兴技术探索其生化和物理化学特性,外泌体在医疗实践中的大规模应用将得到进一步发展,进而对PCOS的研究及其诊断与治疗提供新的思路。