口咽鳞状细胞癌中HPV DNA检测的研究进展

王润堃, 陆汉强, 黄秋生

江苏大学附属医院耳鼻咽喉-头颈外科,江苏镇江 212000

口咽鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma of the oropharynx,OPSCC)是头颈部鳞状细胞癌的重要组成部分,其常见于舌、咽后壁、腭扁桃体、软腭等部位[1]。OPSCC分为两种:由吸烟和饮酒引起的HPV阴性疾病和由性传播感染人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)引起的HPV阳性疾病[2]。

1 口咽鳞状细胞癌的流行病学

目前,OPSCC的全球发病率基本保持稳定,但HPV(+)OPSCC的发病率却在逐年增加,2021年全球范围内HPV(+)OPSCC的发病率约为33%[3]。但HPV(+)OPSCC的发病率在不同的区域有着较大的差异,尤其在发达地区,其发病率要明显高于烟草、酒精引起的HPV(-)OPSCC[4-5]。造成这种差异的原因可能是发达地区的人群对于性行为思维方式的改变,特别是20世纪50年代至60年代发生的性革命,导致人们初次性行为的年龄降低,同时人们开始热衷于口交[6]。口交是诱发HPV(+)OPSCC的最大因素[7],口咽部感染HPV的风险很大程度上取决于近3个月来口交的性伴侣数量[8]。容易罹患HPV(+)OPSCC的人群大都有相似的特征,例如多为白种男性人,有过良好的教育及较高的社会地位,很少有吸烟或酗酒史[9]。

2 HPV的感染及发病机制

HPV通过性传播、母婴传播等途径感染皮肤或者黏膜,进而引起皮肤或黏膜的良、恶性肿瘤[10]。根据病毒对感染细胞的转化程度,HPV可以分为两种亚型:高危险型和低危险型。在不同的亚型中,HPV-16、HPV-18是引起HPV相关疾病的主要亚型。目前,HPV-16被认为是导致HPV(+)OPSCC的关键亚型[1]。HPV(+)OPSCC好发部位大多位于舌根扁桃体和腭扁桃体,一方面其鳞状上皮可以成为遮蔽病毒的场所,另一方面也为病毒进入基底层提供路径[11]。

持续感染是导致癌症发生的关键。当肿瘤抑制基因被破坏,就会出现恶性转化[12]。HPV是一种无包膜的小分子环状DNA病毒,包括结构蛋白(L1、L2)和功能蛋白(E1、E2、E4、E5、E6、E7)[13]。E6和E7是主要的癌蛋白,但其余的蛋白在病毒的复制过程中同样至关重要。例如L1和L2是病毒装配所必需的,而E1、E2和E4是病毒复制和调节复制所必需的[13]。E6和E7已经被证实可以分别抑制肿瘤抑制基因肿瘤蛋白53(tumor protein P53,TP53)和成视网膜细胞瘤基因(retinoblastoma gene,RB)。E6通过抑制肿瘤抑制基因TP53,从而促进细胞增殖。E7通过介导RB使得被转录因子E2F激活的细胞周期蛋白依赖的激酶抑制剂INK4A被抑制,从而促进细胞增殖,并连续导致p16过表达[13]。同时,E6和E7之间也具有协同作用,E6可以抵消E2F介导的凋亡,E7可以保护E6免受INK4A的抑制[14]。

3 口咽鳞状细胞癌中HPV DNA的检测

随着对OPSCC的研究不断深入,多项临床试验表明,HPV(+)OPSCC对辐射的灵敏度要强于HPV(-)OPSCC,并且预后更好[15]。随着根据HPV状态选择降级化治疗的证据不断增加,一些研究人员开始倡导针对HPV(+)OPSCC患者进行降级化治疗以提高患者的生活质量[16]。因此,检测OPSCC患者病变部位的HPV具有潜在的治疗意义。目前针对OPSCC中HPV DNA检测的方法包括HPV DNA/RNA聚合酶链式反应(PCR)、p16免疫组织化学(IHC)和DNA/RNA原位杂交(ISH)检测[17]。PCR是目前检测HPV DNA的金标准,具有高特异度和灵敏度,但存在高成本、耗时长以及实验设备要求高等缺点[18]。p16原位杂交的IHC染色是PCR的替代检测标记,具有价格低廉的优点,但其灵敏度和特异度低于PCR[19]。并且其结果存在病理学家的主观偏差,容易导致假阳性或者假阴性的发生[19]。因此,需要一种简单、省事且经济的方法用于检测OPSCC患者中HPV的状态和亚型。目前,拥有前景的HPV DNA检测方法包括环介导等温扩增技术、数字液滴PCR以及第二代测序技术,以下将对这三种方法进行一一阐述。

3.1 环介导等温扩增技术

环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一种应用等温条件扩增目标DNA的技术,是一系列PCR检测方法的替代[20]。LAMP通过设计4～6条特异度引物对目标基因的6～8个不同区域进行识别,同时由于反应过程中焦磷酸镁的沉淀,结果通过肉眼即可观察,无需使用昂贵且耗时的凝胶电泳和分光光度法进行结果统计,不仅节省了费用而且缩短了检测的时间[21]。已有多种基于LAMP的方案用于疟疾及结核病的检测,并且证实其灵敏度和特异度与PCR相同[22-23]。Hagiwara等[24]在2007年开始将LAMP用于检测HPV高危亚型引起的生殖器病变。随后,Livingstone等[25]提出可以将LAMP用于检测口咽鳞状细胞癌中HPV的高危亚型,指出LAMP具有与PCR相当的灵敏度和特异度,通过使用PCR和LAMP分别检测OPSCC中HPV的部分高危亚型,结果显示,相比于PCR,LAMP的平均灵敏度为99.4%,平均特异度为93.2%。而最容易引起口咽鳞状细胞癌的HPV-16、HPV-18,LAMP检测的灵敏度和特异度分别为97.6%、80.0%以及100.0%、97.7%。但在这项研究并未完全指出LAMP的检测是否同PCR一样需要先进行DNA纯化。因此,Rohatensky等[26]结果表明,LAMP无需DNA纯化即可对OPSCC中的HPV亚型进行检测,进一步凸显了LAMP在检测OPSCC中HPV DNA的潜力。

3.2 数字液滴聚合酶链式反应

数字液滴PCR(droplet digital PCR,ddPCR)是一种基于聚合酶链式反应(PCR)的新型技术。在进行传统的PCR操作前,将反应体系分成数个微小的液滴,每个液滴都包含PCR反应所需要的DNA模板以及试剂,从而使得每个液滴都可以进行独立扩增[27]。与传统的PCR技术相比,ddPCR可以在不使用校准曲线的情况下进行核酸定量,同时在模板浓度较低的情况下拥有比传统PCR技术更高的精确度、灵敏度以及检出率[28]。

目前,使用ddPCR检测HPV的方案已经在多种组织样本中得到了证实。Schiavetto等[29]通过ddPCR检测使用福尔马林固定石蜡包埋处理的样本(FFPE)中HPV DNA的含量与p16 IHC进行对比,发现结果具有一致性。同时指出,p16 IHC与ddPCR联合使用时可以显著提高诊断HPV(+)OPSCC的特异度,更好的进行预防、筛查和指导治疗[29]。Biron等[30]使用市面上售卖的商用试剂盒从OPSCC组织、细针穿刺抽吸样本以及口咽拭子样本中提取足量的HPV-16 RNA,通过与p16 IHC对比发现,ddPCR检测HPV E6/E7的灵敏度和特异度分别为91.3%和100%。Isaac等[31]在OPSCC患者的口咽拭子中检测到HPV-16,并通过与p16 IHC检测手术标本的结果对比发现,ddPCR检测结果有92%的灵敏度和98%的特异度,进一步表明了ddPCR检测HPV DNA具有良好的灵敏度和特异度,且无需进行有创的组织活检。

ddPCR的缺点在于需要使用材料进行各亚型的独立检测。ddPCR的一种替代方法是第二代测序技术,可以在一次测试中捕获多种亚型,并产生更高的灵敏度。

3.3 第二代测序技术

第二代测序技术(next-generation sequencing,NGS),又称为下一代测序技术。该技术是以第一代测序技术为基础,以低成本、99%以上的准确度,1次可对几百、几千个样本的几十万至几百万条DNA分子同时进行快速测序分析[32]。基于第二代测序技术的病毒宏观基因组学弥补了传统检测方法的不足,有望成为研究病毒的有效技术[33]。

Lee等[34]在一项前瞻性研究中使用NGS评估HPV ct DNA在监测局部晚期HNSCC患者在接受初次放化疗(CCRT)后疾病的反应。这项研究中共纳入75例OPSCC患者,其中实验组47例,对照组28例。结果显示,NGS检测HPV ct DNA在确定肿瘤组织中HPV16状态具有100%的灵敏度和特异度。Lee等[35]随后在2020年的一项前瞻性研究中使用NGS检测接受放化疗的肛门鳞状细胞癌患者血液中的HPV DNA,结果显示NGS对血液中HPV ct DNA的检测具有100%的灵敏度和特异度。Sastre-Garau等[36]指出,使用NGS检测不同肿瘤部位患者血液中不同HPV ct DNA的灵敏度和特异度分别为95.0%和98.1%;并指出临床分期与检测灵敏度呈正相关,T1期肿瘤检出率为72.7%,T2为95.9%,T3/T4为100%;所有淋巴结阳性或转移阳性的肿瘤均为HPV ct DNA阳性(灵敏度为100%,特异度为97.4%)。

4 小 结

越来越多的研究表明HPV的状态可能会对OPSCC的分期、治疗以及预后产生影响,特别是支持HPV(+)OPSCC患者降级化治疗的专家越来越多,选择合适的HPV检测方法愈发重要。目前HPV的检测可以通过PCR、p16 IHC以及ISH单独或者联合使用来进行。PCR是目前检测HPV DNA的金标准,p16 IHC是临床诊断中的替代标记物。但不论是PCR还是p16 IHC或者其他检测方法,每一种方法都有各自的优缺点。选择最佳的检测方法,需要考虑成本、耗时以及操作难度。目前尚未对OPSCC中HPV DNA的检测达成共识,但基于传统检测方法的新技术被不断开发出来,并有着较高的灵敏度和特异度。本文并未对传统的检测方法进行总结,而是将目光放在了目前具有前景的HPV DNA检测方法,但这些方法仍存在结果假阳性或者假阴性的可能。目前最有前景的检测方法是第二代测序技术,该项技术已经在EB病毒(epstein-Barr virus,EBV)相关的鼻咽癌中显示出了巨大的前景,随着测序技术的不断发展,检测HPV ct DNA很有可能成为新的、有价值的HPV生物标记物。