儿童侵袭性流感嗜血杆菌的临床特征及血清型和耐药性

聂曼杰,孙曹玮,周娟娟,高凯杰

(郑州大学附属儿童医院/河南省儿童医院郑州儿童医院,检验科/郑州市儿童感染与免疫重点实验室,河南 郑州 450000)

侵袭性流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae,Hi)定义为从无菌体液分离出来的,可侵入血流引起败血症、化脓性脑膜炎、肺炎和化脓性骨关节炎等侵袭性感染,患者病情重、进展快、病死率高[1]。非b型Hi血清型和不可分型流感嗜血杆菌(non-typeable Hi,NTHi)在临床感染中检出率逐渐升高[2],对抗菌药物日益耐药[3],主要耐药机制是产生β-内酰胺酶以及fts基因突变。本研究分析临床分离得到的侵袭性Hi的荚膜血清分型、产生β-内酰胺酶表型以及抗菌药物耐药特点,深入了解并监测本地区儿童感染侵袭性Hi的动态,为新疫苗的研发提供科学依据,提高临床对Hi侵袭性感染的重视。

1 资料与方法

1.1 标本来源回顾性研究2016年1月至2022年1月郑州大学附属儿童医院住院患儿无菌部位(血液、脑脊液、胸腹水、骨髓液等)感染Hi的病例,分析其分离菌株;每位患儿取1株分离株,对于多部位感染的患儿,优先选择来自脑脊液或胸腹水的分离株[4]。

1.2 仪器与试剂Bact/ALERT 3D血培养仪(法国生物梅里埃股份有限公司)、Vitek2-Compact微生物鉴定药敏分析仪(法国生物梅里埃股份有限公司)、MALDI-TOF Biotyper质谱仪[布鲁克(北京)科技有限公司]。荚膜分型血清(丹麦SSI Diagnostica公司)、万古霉素巧克力琼脂培养基(广州迪景微生物科技有限公司)、HTM培养基(广州迪景微生物科技有限公司)、E-test条(法国生物梅里埃股份有限公司)、药敏纸片(英国OXID公司)。

1.3 方法

1.3.1临床资料分析 记录并分析患儿的体温、白细胞、降钙素原(procalcitonin,PCT)、C-反应蛋白(C-reactive protein,CRP)实验室检查结果以及抗菌治疗效果。

1.3.2细菌培养及鉴定 按《全国临床检验操作规程》第4版[5]要求接种到添加万古霉素的巧克力培养基,置35 ℃培养18～24 h,根据菌落特点和显微镜检查结果,挑取光滑湿润、呈灰白半透明或无色透明的菌落,镜检为革兰阴性的小杆菌,用生物质谱仪MALDI-TOF Biotyper进行鉴定。质控菌株Hi ATCC 49247购自国家卫生与健康委员会临床检验中心。

1.3.3药敏试验 采用E-test方法检测Hi对氨苄西林的最小抑菌浓度,应用K-B纸片法检测其对氨苄西林/舒巴坦、头孢呋辛、阿奇霉素、美罗培南、左氧氟沙星等药物的敏感性。结果判读依据2018年美国临床和实验室标准化协会文件药敏标准[6]。用头孢硝噻吩纸片显色法试验定性检测β-内酰胺酶,用金黄色葡萄球菌ATCC29213作为阳性对照,质控菌株Hi ATCC 49247购自国家卫生与健康委员会临床检验中心。

1.3.4荚膜血清学分型 用Hi多价血清(a、b、c、d、e、f)型和b型血清通过乳胶凝集法对纯化后的侵袭性Hi进行血清学分型,产生凝集反应为阳性。同时用9 g·L-1的氯化钠溶液作为对照,注意是否存在自凝集菌株。

1.4 统计学方法应用WHO细菌耐药性监测网提供的WHONET 5.6版本软件进行抗菌药物敏感性分析,计数资料以频数(n)和百分比(%)表示,采用χ2检验比较。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患者一般资料2016—2022年确诊侵袭性Hi的例数分别为2、5、8、12、2、2、2例;1—12月例数分别为5、4、0、3、1、4、0、4、3、4、3、2例。33例患儿中血液、脑脊液和骨髓液中同时检出2例,血液和脑脊液同时检出9例,血液、脑脊液、腹水和胸腔积液分别检出17、2、2、1例。33例患儿中5例检出2种及以上细菌;11例患有基础疾病(3例头颅外伤、3例白血病、2例早产儿、1例急性阑尾炎伴穿孔、1例慢性肾病、1例先天性心脏病);最小年龄为1日龄,最大年龄为9岁;1例患儿体温正常(早产儿血流感染)。2例腹腔感染分别为慢性肾脏病5期在腹膜透析时感染和急性阑尾炎引起感染,1例胸腔积液感染因外伤致急性呼吸衰竭全身免疫力低下所致。32例患儿发热,31例患儿接受了PCT检查,16例患儿白细胞异常,22例患儿出现并发症。具体见表1。

表1 侵袭性Hi感染患儿的一般资料

2.2 药敏试验及β-内酰胺酶检测最初鉴定出46株侵袭性Hi(来自血液28株、脑脊液13株、骨髓液2株、腹水2株、胸腔积液1株),排除了13株重复分离株,排除因死亡或自动出院未做药敏试验的4例患儿,共对29株侵袭性Hi进行药敏试验分析(表2)。另阿奇霉素和美罗培南敏感率为44.8%(13/29)和96.6%(28/29),在β-内酰胺酶阳性中敏感率分别为26.3%(5/19)和94.7%(18/19),在β-内酰胺酶阴性中则全部非敏感。环丙沙星为喹诺酮类抗生素,考虑到儿童安全用药,故不推荐临床首选用药;三代头孢(头孢他啶、头孢噻肟)和美罗培南敏感率高,可为临床首选用药。

表2 29株侵袭性Hi对常见抗菌药物敏感性

2.3 Hi荚膜分型用荚膜血清对29株侵袭性Hi菌株采用乳胶凝集法进行分型,与b型血清和多价血清均无凝集反应,29株菌株全部为NTHi。

2.4 治疗及转归针对29例有药敏结果的患儿,其中16例(55.2%)应用单一抗菌药物治疗(包括三代头孢12例、亚胺培南2例、美罗培南1例、阿奇霉素1例);10例(34.5%)联合应用2类抗菌药物治疗(包括碳青霉烯类联合头孢菌素4例,头孢菌素联合大环内酯类、碳青霉烯类联合万古霉素、碳青霉烯类联合氯霉素类、头孢菌素联合万古霉素、碳青霉烯类联合青霉素类、头孢菌素联合青霉素类各1例);3例(10.3%)在病程中先后使用3种及以上抗菌药物治疗(主要为头孢菌素、碳青霉烯类、万古霉素和青霉素类联合应用)。临床治疗中根据药敏结果调整用药,27例(93.1%)患儿治愈或好转出院,2例(6.9%)死亡或自动出院后死亡,为严重外伤或感染的重症患儿,病程中均使用3种以上抗菌药物治疗。

3 讨论

Hi感染主要累及5岁以下尤其是1岁以下患儿[7],本研究中<1岁婴儿和3～6岁学龄前儿童易感染侵袭性Hi,婴儿免疫功能发育不完善和学龄前儿童接触环境复杂等因素为其主要易感原因。研究期间儿童侵袭性Hi发病率在2016—2019年逐渐升高,全年均可发病,无明显季节性,与其他研究结果[8]基本一致,但在2020年和2021年有明显下降趋势,这可能与新型冠状病毒大流行背景下,各种防疫措施加强有关。本研究中11例有基础疾病,主要为外伤、免疫力低下及先天性疾病,这些因素都为Hi入侵提供了基础。临床实践中应积极采取措施防治。患儿因白血病化疗、血液透析等致免疫力降低,Hi由定植部位入侵无菌部位引起感染,考虑为院内感染,应高度警惕此类机会致病菌的侵袭性感染。

Hi侵入人体,引发炎症反应,体温升高,所以发热为患者的最主要临床表现,多数患者的CRP、PCT等炎症标志物水平升高。本研究中患儿高热及超高热较多,但白细胞、细菌内毒素等指标无明显升高,与其他研究[8]不完全相同,这为患儿诊治造成干扰。Hi侵袭性感染易引起败血症、化脓性脑膜炎等[9],本研究中血流感染及化脓性脑膜炎占比分别为84.8%(28/33)、39.4%(13/33)。

氨苄西林等β-内酰胺酶类药物既往被认为主要的抗Hi药物[10],但近年来耐药率持续升高[11-12],本研究中侵袭性Hi对复方磺胺甲噁唑、氨苄西林耐药率分别达86.2%、79.3%,侵袭性Hi中65.5%β-内酰胺酶阳性,高于其他研究[8,13]结果及本实验室之前的研究[14]结果,对侵袭性感染患儿救治提出了较大挑战。根据最新美国临床和实验室标准协会药敏试验规范,流感嗜血杆菌对阿奇霉素和美罗培南只有敏感折点,高于敏感折点的无法区分耐药或中介故只能按照“非敏感”报告及统计。侵袭性Hi对阿奇霉素非敏感率达到55.2%,证实大环内酯类药物不宜作为治疗Hi感染的经验用药;对三代头孢、美罗培南的敏感率高,重症患儿可经验性选用。其中1例患儿,前期用美罗培南及万古霉素抗感染,后根据血培养双瓶为Hi且对三代头孢(头孢他啶、头孢噻肟)及美罗培南为非敏感,仅对氯霉素及环丙沙星敏感,请临床药师会诊后考虑感染严重。环丙沙星属于喹诺酮类抗生素,出于安全性考虑,喹诺酮类药物在儿童中的应用比较谨慎。美国FDA(食品与药物管理局)批准的、儿童中氟喹诺酮类适应证包括:治疗有并发症的尿路感染和肾盂肾炎,以及预防和治疗吸入性炭疽。临床实际应用中,在充分评估风险和获益的情况下,针对重症感染、耐多药病原菌感染等可酌情使用[15-16]。因此,会诊后给予患儿氯霉素联合超广谱抗生素美罗培南(碳青霉烯类)抵抗感染,疗效良好,血培养Hi为阴性,后因病情严重心搏骤停死亡。本研究中大部分患儿应用Hi敏感抗生素(三代头孢、碳青霉烯类等)治疗,但抗生素使用种类较多,多种抗菌药物联合用药不够合理,如碳青霉烯类或头孢菌素联合青霉素类较多,部分患儿药敏结果明确后未及时调整用药,虽与侵袭性感染患儿情况危重有关,但仍需进一步提高抗菌药物合理应用。研究中侵袭性Hi对三代头孢(头孢他啶、头孢噻肟)和美罗培南的耐药率低、敏感率高,可以考虑作为临床首选药物。

有研究显示107株Hi中67.3% β-内酰胺酶阳性,90.9% NTHi,9.3% β-内酰胺酶阴性对氨苄西林耐药[17]。四川一项研究表明19株试验菌都是NTHi[18],由于基因水平转移,期相变换,噬菌体等作用,NTHi已拥有了侵袭性荚膜型b型Hi的相关毒力因子,且致病力比b型Hi疫苗投入使用前更强[19]。而此次研究的29株侵袭性Hi均为NTHi,40.0% β-内酰胺酶阴性氨苄西林耐药,耐药性强,应该引起重视。β-内酰胺酶阳性菌株对抗生素耐药性普遍高于β-内酰胺酶阴性菌株,表明侵袭性Hi对抗生素耐药主要是由于产生β-内酰胺酶而引起。产生β-内酰胺酶菌株对氨苄西林和阿奇霉素耐药性高于非产酶菌株,但跟李静等[20]的研究结果有出入,考虑与标本类型以及数量的差异有关。40.0%侵袭性Hi为β-内酰胺酶阴性氨苄西林耐药菌株,多由细胞壁青霉素结合蛋白3编码基因ftsI突变导致[21]。少数情况下,有荚膜菌株为适应环境会停止生成荚膜,故单纯血清分型会被误判为NTHi[7],需更严谨地进行荚膜基因检测。

本研究下一步将收集菌株,扩增后进行基因测序,明确耐药基因的类型及ftsI基因是否有氨基酸置换,结合基因测序结果综合分析菌株的同源性以及之间的联系,进一步了解并监测本地区儿童侵袭性Hi的流行病学、耐药机制、基因突变在耐药中的影响,为新疫苗的研发提供科学依据。