黑老虎新品系的SSR指纹图谱构建

邹建文　饶红欣　陈灵　罗先权　何润华　陈铭　何艳

关键词：黑老虎；DNA 指纹图谱；遗传多样性；亲缘关系

中图分类号：S567.19 文献标识码：A

黑老虎（Kadsura coccinea）俗称冷饭团，为五味子科（Schisandraceae）南五味子属一种常绿木质藤本植物。黑老虎是一种食药兼用的新型珍稀水果，具有较高的药用价值和营养保健功效，而且其果形奇特、果期长，亦具有独特的观赏价值，在中药材、水果和食品以及园林绿化美化等方面颇具发展潜力[1]。近年来，随着其果实和相关产品在国内市场不断走俏，黑老虎在湖南、广西、贵州和云南等省（区）得到大力发展，一些市（县）形成了产业化发展格局，有力推动了国家乡村振兴战略的实施。尤其在湖南通道县，黑老虎的种植规模迅速扩大，并且获评国家地理标志农产品[2]。在黑老虎的规模发展过程中，科研人员开展了黑老虎新种质的挖掘和选育研究，并通过嫁接推广应用。目前已涌现出一批在果形、果色、口感、早实性等方面具特异性的品种（系）。

由于黑老虎的种质特异性，以果实及其经济性状为主，加之生长环境导致的营养器官形态变异也较大，在结实前依据形态性状较难鉴别。由于DNA 标记不受环境和发育时期的影响，构建DNA 指纹图谱是一种快速且准确的途径[3]。SSR标记具有多态性高、共显性遗传、测试操作简单、结果重复性好等优点，被国际植物新品种权保护联盟（International  Union for the Protection of NewVarieties of Plants， UPOV）确定为构建植物品种（系）DNA 指纹数据库的首选标记[4]，已在宝巾花[5]、梨属[6]、仁用杏[7]、核桃[8]、薄壳山核桃[9]、苦参[10]以及杨树[11-12]等观赏、食用、药用以及材用植物品种（系）DNA 指纹图谱上得到广泛应用。本研究应用SSR 标记技术分析湖南省选育的20个黑老虎品系的遗传多样性，探明其亲缘关系，构建SSR 指纹图谱，旨在为黑老虎品种（系）鉴定以及新品种（系）选育与创制提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

20个黑老虎品系来自湖南省通道县独坡镇虾团村、芷江县大树坳乡竹坡村和芷江县三道坑镇芷溪村（表1）。其中，通道县独坡镇虾团村自2004年以来开始发展黑老虎，建立了平宽黑老虎专业合作社，湖南省植物园与当地种植大户合作收集、保存了大量黑老虎种质资源，部分品系即来自该种质资源圃；其他品系是利用芷江县大树坳乡竹坡村和三道坑镇芷溪村天然次生林内的黑老虎优株经嫁接而获得。部分品系特征见图1。对每个品系采集其嫩叶，用硅胶（质量比为1∶10）干燥带回实验室。

1.2 方法

DNA 提取和SSR 分析。采用改良的CTAB法[13]提取DNA，从前期开发的28 对SSR 引种中选择15 对（表2），应用M13-tailed 引物法进行SSR 分析[1]。采用10 μL 的PCR 扩增反应体系：DNA 模板50 ng，dNTPs 150 μmol/L，MgCl22.0 μmol/L，M13 荧光标记引物0.5 μmol/L，M13荧光标记的正向引物0.5 μmol/L，反向引物0.5 μmol/L，1×PCR 缓冲液以及Taq DNA 聚合酶0.04 U/μL。PCR 缓冲液和Taq DNA 聚合酶由天根生化科技（北京）有限公司生产。在PCR 扩增仪Master cycler Gradient Thermal Cycler （Eppendorf）上进行扩增反应，其程序为：4 min 94 ℃预变性；30 s 94 ℃变性，30 s 60 ℃退火，30 s 72 ℃延伸，循环30 次；10 min 72 ℃延伸。选用GeneScan500 LIZ Size Standard（Applied Biosystems， USA）为内标，采用3730XL 自动测序仪（Applied Biosystems，USA）检测PCR 产物的多态性。应用GeneMarker V2.2.0 软件[14]判读基因型。

1.3 数据处理

应用Excel 软件统计每个位点的基因型数量、特异等位基因数（Ap）以及鉴定品系数。应用GenAlEx 6 软件[15]计算每位点的等位基因数（A）、有效等位基因数（Ae）、Shannon 信息指数（I）、观测杂合度（Ho）；基于等位基因频率，采用公式PICi=1-ΣPij2 计算多态信息含量（PIC），PIi=2（ΣPij2）2-ΣPij4 计算基因型相同的概率（PI），其中Pij 为位点i 等位基因j 的频率[16]；按照各位点及其等位基因的有无构建（ 0， 1 ） 矩阵， 应用NYSYS-pc 2.1 软件[17]计算品系间的Neis（1972）遗传距离，基于遺传距离进行UPGMA（非加权组平均法）聚类分析，绘制亲缘关系树状图。

2 结果与分析

2.1 遗传多样性分析

15对SSR 引物在20 个黑老虎品系中共检测到108 个基因型，76 个等位基因，其中18 个为特异等位基因，仅在1 个品系中出现。每个位点的等位基因数（A）为2～15，有效等位基因数（Ae）为1.105～9.412，均以KCZ023 位点最高，15 个位点的A 和Ae 的平均值分别为5.067 和2.866。特异等位基因数（Ap）以KCZ023 和KCZ100 最多，均有4 个。Shannon 信息指数（I）为0.199～2.456，观测杂合度（Ho）为0.100～0.900，多态信息含量（PIC）为0.095～0.894，亦均以KCZ023位点最高，15 个位点的I、Ho 和PIC 的平均值分别为1.106、0.473 和0.562。基因型相同的概率（PI）为0.020～0.824，以KCZ023 位点为最低（表3）。

2.2 亲缘关系分析

20 个黑老虎品系间Neis（1972）遗传相似系数为0.328～0.891，以TD07 与TD43 间遗传相似系数最大，TD45 与TD46 间遗传相似系数最小，其平均值为0.614（表4）。聚类分析发现，以遗传相似系数0.57 为阈值可将20 个品系分为2 个类群：TD21、TD22、TD42、TD43、TD47、TD50、TD51 和TD54 等8 个品系聚为一类（I）；其他12个品系聚为一类（II）。以遗传相似系数0.62 为阈值可将第II 类群分为3 个组：TD07、TD41、TD45、TD46、TD52、ZJ34、ZJ40 等7 个品系为一组；TD08 和TD19 为一组；TD23、TD40、TD44 为一组（图2）。

2.3 DNA 指纹图谱构建

由表5 可知，15 个SSR 位点均不能单独将20 个黑老虎品系完全区分开。其中，KCZ023 位点的区分能力最强，能单独鉴别15 个品系，占75%；其次为KCZ035 位点，能单独区分7 个品系，占35%；再次为KCZ100 和KCZ113，均能单独鉴定出5 个品系，占25%；KCZ029、KCZ058和KCZ061 位点均不能单独区分任何品系。

从表5 可以看出，位点两两组合中，KCZ023与KCZ059、KCZ023 与KCZ135 以及KCZ023 与KCZ147 等3 个组合中的任意一个均能将20 个品系完全区分，其他组合均不能将20 个品系完全区分。3 位点组合中，共有28 个组合能将20 个黑老虎品系完全区分，包括：（1）KCZ023 与KCZ035或KCZ023 与KCZ100，加上KCZ036、KCZ057、KCZ061、KCZ103 和KCZ113 的任意一个位点，计10 个组合；（2）KCZ035 与KCZ057，或KCZ035与KCZ059，或KCZ035 与KCZ100，加上KCZ103或KCZ135，计6 个组合；（3）KCZ035 与KCZ113加上KCZ059 或KCZ100 ， 以及KCZ035 与KCZ147 加上KCZ057 或KCZ059，计4 个组合；（ 4 ） KCZ035 与KCZ103 加上KCZ113 或KCZ135，以及KCZ035 与KCZ113 加上KCZ135或KCZ147，计4 个组合；（5）KCZ035、KCZ036和KCZ059，KCZ035、KCZ135 和KCZ147，KCZ057、KCZ100 和KCZ113 以及KCZ100、KCZ113 和KCZ135 等4 个组合。

3讨论

本研究应用15对SSR 引物研究了20 个黑老虎品系的遗传多样性，检测到76 个等位基因、18个特异等位基因和108个基因型，尤其是KCZ023位点具有15 个等位基因，高于该位点在城步、桂东和会同3 个天然群体所检测到的等位基因数（13）[1]，而且该位点对于黑老虎品系的区分能力最强，可单独区分15 个品系，可作为黑老虎品系鉴定的核心位点。20 个品系的多态信息含量（PIC）为0.095～0.894，绝大多数高于城步、桂东和会同3 个天然群体[1]，说明20 个黑老虎品系具有较高的遗传多样性。其原因可能是：尽管20个品系绝大部分来自湖南通道县独坡镇虾团村，由于通道县位于湖南、贵州和广西三省（区）交界处，亦是人工种植黑老虎最早的地区之一[2]，当地种植大户从各地广泛收集黑老虎种质资源进行种植，湖南省植物园在当地种植大户的基础上也开展了黑老虎种质资源的收集、保存和新品种（系）选育研究，使选育的品种（系）多样性较为丰富。

20个黑老虎品系间的遗传相似系数为0.328～0.891，依据遗传相似系数进行UPGMA聚类分析，可将20 个黑老虎品系划分为2 个类群，其亲缘关系与各品系的果色、果形、风味等性状并无明显的相关性。如，TD45 和TD46 两个品系的亲缘关系最近，而果实颜色迥异，分别为紫黑色和粉色；同为早熟的TD44 和TD47 两个品系的亲缘关系较远，分别属于不同的类群；亲缘关系最远的2个品系TD07 和TD43 在果色和口感上也差异明显，前者为虎绿、口感一般，而后者通常为紫红色，果肉多且甜。这与本研究使用的SSR 标记有关，因为这些SSR 标记是通过简化基因组测序开发而获得的[1]，多为中性标记。

目前黑老虎种质主要通过嫁接方式无性系化进行推广应用。本研究构建了20 个黑老虎品系的SSR 指纹图谱，从3 个2 位点组合和28 个3 位点组合中选择任意组合均能将20个品系完全区分。15 个位点中，满足PIC＞0.5 和PI＜0.2 的位点为KCZ023、KCZ035、KCZ059、KCZ100、KCZ113和KCZ135，说明这些位点均具有足够的区分能力[16]，其组合可优先应用于黑老虎品系的鉴定。尽管严格意义上而言，对于有限数量的品系，DNA 指纹图谱可用于区分品系，但未能应用于直接鉴定[18]。然而这20 个品系涵盖了目前生产上应用的种质，应用这些SSR 指纹图谱，可以区分在形态上相似的品系，如，果色同为虎绿的TD07和TD52，同为长形果的TD42 和TD50；亦可以为黑老虎品系嫁接苗的管理提供参考[19]。

综上所述，本研究揭示了20个黑老虎品系的遗传多样性和亲缘关系，构建了SSR 指纹图谱，能够准确区分这些品系，不仅利于黑老虎品种（系）鉴定，也可应用于黑老虎的杂交亲本选配。黑老虎具有保健食用、药用以及观赏价值，随着新种质的不断挖掘，新品种（系）将不断涌现，SSR指纹图谱也需要不断更新；另一方面，针对其表型性狀的独特性开发转录组SSR 标记，并应用于SSR 指纹图谱构建，从而使指纹图谱更好地应用于生产实践。