蝴蝶兰PhPIF4基因的克隆与响应GA3表达分析

张英杰　刘民晓　孙纪霞　张京伟　郭文姣　吕晓惠　吕英民

关键词：蝴蝶兰；PhPIF4；生长调节剂；GA3

中图分类号：S688 文献标识码：A

蝴蝶兰（Phalaenopsis spp.）是兰科蝴蝶兰属植物的统称，是我国销售量最大的年宵盆花花卉，也是国际畅销的盆花种类[1-2]。我国蝴蝶兰盆花上市时间主要在春节前，因此蝴蝶兰花期精准调控尤为重要。目前在拟南芥中，已确定了6 个调控开花时间的途径：光周期、春化、赤霉素、温度、自主和年龄途径[3-10]。本课题组在前期蝴蝶兰成花转录组数据中挖掘了大量的成花途径关键基因，其中PhPIF4 基因在成花途径中表达量显著增加（未发表数据），成花转变（抽梗）和小花原基分化期（花梗长10 cm）基因FPKM 值，较低温处理前增长了22 倍和38 倍。PIF（phytochromeinteracting factor）蛋白是一类能够与激活状态的光敏色素phyB 互作进而响应光信号的bHLH（basic helix–loop–helix）类型转录因子，在植物生长发育中起到“枢纽”作用，参与植物体内多信号通路调控植物的生长发育[11]。在植物体内，PIF 可能通过整合光和温度[12] 2 种关键的环境信号转导途径，参与生物钟对内源激素信号网络的调控，使植物能够迅速地适应周围的环境并精确调控其发育进程。研究发现，在高温条件下，PIF4、生长素和植物伸长生长之间存在直接的分子联系[13]。正常的生长素反应需要赤霉素（GA）的促进作用[14]。PIF4 通过与DELLA 互作影响赤霉素的合成与功能发挥[15]。由PIF4 介导的生长素和GA 的串扰作用也可能作用于植物成花。因此，PIF4 可能在光、温度和激素等多途径成花复杂网络中扮演重要角色。

本研究通过对蝴蝶兰成花转录组数据分析挖掘出来的PhPIF4 基因进行克隆和生物信息学分析，以及对生长调节剂GA3 的响应表达分析，以期阐明PhPIF4 基因的调控机制，对蝴蝶兰遗传改良、生长调节剂的应用技术提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试蝴蝶兰品种大辣椒（Big Chilli）引自厦门和鸣花卉科技有限公司，在山东省烟台市农业科学研究院内栽培2 年。选用健康、无病虫害、长势基本一致的4 叶1 心的成熟苗进行试验。

1.2 方法

1.2.1 PhPIF4 基因序列的获取与分析 PhPIF4基因序列源自本实验室的转录组数据（NCBI ShortRead Achieve 数据库中登录号：PRJNA783677，>TRINITY_DN38810_c0_g1_i3_3_2）。利用BLAST网站预测PIF4 氨基酸序列中的保守结构域。用DNAMAN（version 7）软件进行氨基酸序列比对和保守结构域分析，通过clustal X 软件进行氨基酸序列同源性比较，通过GeneDoc 绘制多重序列比对图，利用MEGA 5.0 系统进化分析软件构建系统进化树。通过ExPASy（http：//expasy.org/cgibin/pi_tool）在线软件分析蛋白质的分子量和理论等电点，利用SignalP4.0Server 软件分析蛋白信号肽，利用SOPMA 分析蛋白二级结构，利用Phyre2分析蛋白三维结构。

1.2.2 亚细胞定位 将整个PhPIF4 编码区扩增并克隆到pBWA（V）HS-GLosgfp 中，酶切连接后将连接产物转化大肠杆菌感受态。用酶解液制备拟南芥幼苗叶片细胞原生质体，然后在PEG-4000的作用下将pBWA（V）HS-PhPIF4-GLosgfp 和pBWA（V）HS-GLosgfp 导入原生质体。采用激光共聚焦显微镜（Nikon C2-ER）观察PhPIF4 定位。

1.2.3 生长调节剂对成花的影响 试验组在转入低温处理2 h 和10、20、30 d 后分别喷施GA3 （ T1：100 mg/L，T2：200 mg/L，T3：300 mg/L）、6-BA（T4：100 mg/L，T5：200 mg/L，T6：300 mg/L），100 mg/L GA3+100 mg/L 6-BA（T7）及300 mg/LGA3+300 mg/L 6-BA（T8）共8 組处理，清水为对照（CK）。每组处理15 株，每株喷施5 mL，主要喷施第3 和第4 叶基部，设3 次重复。统计第1 朵花的开放和凋谢日期、花梗长度和花量。用Microsoft Excel 2010 软件处理数据及制图，用SPSS 19.0 软件对数据进行统计分析。

1.2.4 PhPIF4 基因时空表达及响应GA3 表达 在蝴蝶兰DBB（潜伏芽期，低温处理前20 d）、IFB（花序原基分化期，花芽0.5～1 cm）、FBD（小花原基分化期，花梗10 cm）、FB（现蕾期，花梗30 cm）4 个时期分别取喷施GA3 300 mg/L 处理组及对照组的芽点（潜伏芽、花芽和花梗顶端0.5 cm）、叶片和根尖进行qRT-PCR。使用RNA提取试剂盒提取各组织的总RNA，反转录合成cDNA 第一链，并以cDNA 为模板进行qRT-PCR。引物PIF4（+） ： GTTCCAATACCACCCTTAC ，PIF4（–）：GTCAG CGGAAATAATAGTCTGT。每个RT 反应分2 步。第1 步将0.5 μg RNA、2 μL4×gDNA wiper Mi，加入无核酸酶的H2O 至8 μL。在GeneAmp? PCR System 9700 （Applied Biosystems，USA）中，42 ℃下反应2 min。第2 步加入2 μL 的5×HiScript II Q RT SuperMix IIa，反应在GeneAmp PCR System 9700（Applied Biosystems，USA）中进行，50 ℃下反应15 min，85 ℃下反应5 s。然后将10 μL 的RTRT reaction mix用nuclease-free water 稀释10 倍，–20 ℃保存。采用LightCycler? 480 Ⅱ Real-time PCR Instrument（Roche， Swiss）进行Real-time PCR，PCR 反应混合物为10 μL，其中cDNA1 μL，2×ChamQ SYBRqPCR Master Mix 5 μL，正引物0.2 μL，反引物0.2 μL，nuclease-free water 3.6 μL。在384 孔光学板（Roche， Swiss）中95 ℃培养30 s，然后进行40 个循环，95 ℃培养10 s，60 ℃培养30 s。每个样本重复3 次。据扩增曲线确定基因的Ct 值，表达量的计算采用2-ΔΔCT 法。

2 结果与分析

2.1 PhPIF4 基因序列分析

蝴蝶兰大辣椒PhPIF4 基因ORF 全长为539 bp，编码176 个氨基酸。ProtParam 软件分析表明PhPIF4 分子式为C854H1333N241O250S17，分子量为19 521.46；理论等电点（pI）为7.05，其中包含正电残基（Asp+Glu）8 个、负电残基（Arg+ Lys）8 个，理论半衰期为体外哺乳动物网织红细胞30 h、在酵母体内>20 h、在大肠杆菌体内>10 h，不稳定指数是67.48，脂溶指数是68.24，属于不稳定蛋白，平均亲水性值为-0.38，为两性蛋白，编码蛋白不含信号肽。对其二级结构和三维结构的分析发现，PhPIF4 蛋白中不规则卷曲结构所占比例为78%，α-螺旋比例为35%，β-转角为0%（图1）。利用NCBI网站进行保守结构域分析，发现PhPIF4 基因编码的氨基酸具有bHLH_SF super family（cl00081）同源异型盒家族的典型保守结构域（图2）。将PhPIF4氨基酸序列与小兰屿蝴蝶兰（Phalaenopsis equestris，PhaPIF4， XP_020586384.1） 、建兰（Cymbidiumensifolium， CyPIF4， QDL88406.1 ） 、墨兰（Cymbidium sinense， CymPIF4， QDH08906.1）、石斛兰（ Dendrobium catenatum， DePIF13，XP_020694614.2 ） 、鼓槌石斛（ Dendrobiumchrysotoxum， DeIEQ34， KAH0453999.1）进行比对，并与15 个物种PIF4 建立系统进化树，结果表明，大辣椒PhPIF4 与小兰屿蝴蝶兰亲缘关系较近，其次为建兰、墨兰和石斛兰（圖3）。

2.2 PhPIF4 亚细胞定位分析

在瞬时转化35S-GFP 空载体的拟南芥原生质体中，GFP 基因大量表达，绿色荧光信号在细胞质、质膜和细胞核中均有分布。而在瞬时转化35S-PIF4-GFP 的拟南芥原生质体中，绿色荧光信号主要分布于细胞器上，细胞质、叶绿体和细胞核中均未检测到明显的荧光信号，表明PhPIF4 蛋白定位于非叶绿体的细胞器中（图4）。

2.3 生长调节剂GA3对成花的影响

不同浓度GA3 处理均增加了蝴蝶兰花梗长度，使花期提前9～11 d，但对花径和花量均无显著影响。花梗最长的处理组是200 mg/L GA3，然而不同浓度GA3 处理的花梗长度增加的差异不显著。6-BA 可显著增加蝴蝶兰花量，花量最多的处理组为300 mg/L 6-BA，但6-BA 对花期和花梗长度无显著作用。GA3 和6-BA 混合使用时，对蝴蝶兰开花时间和花期的影响介于二者之间（图5）。

2.4 PhPIF4 基因表达量分析

在蝴蝶兰花发育过程中，PhPIF4 基因在花芽、叶和根中的表达量变化不同（图6）。在花芽中表达量变化相对较小，在叶片中表达量逐渐增加，在根中增加最显著，FB 期较DBB 期增加了10 倍以上。但不论在哪种器官中，该基因均在FB 期表达量最大。喷施生长调节剂GA3 后，PhPIF4 基因在花芽、叶和根中的表达量均有所增加，且在FB 期增加量最大，表明PhPIF4 基因的表达可能受GA3 影响与调控。

3 讨论

在蝴蝶兰生产栽培中，低温、长日照和植物生长调节剂是重要的催花技术手段。夜间18～20 ℃、白天23～26 ℃的相对低温处理40～50 d[16]以及增强光照可提前蝴蝶兰的自然花期以供应我国年宵用花。光照可促进蝴蝶兰成花，光周期对蝴蝶兰开花的影响不明显，但增加光强可增加花序数量，加速抽梗[17]。降低光辐照可以延缓蝴蝶兰的花梗发育，从而推迟蝴蝶兰的开花时间[18]。这可能与蝴蝶兰属于景天酸代谢（CAM）植物有关，CAM受昼夜节律和光质[19]影响。拟南芥中许多bHLH转录因子的表达具有昼夜节律性，如bHLH69 和bHLH92[20]。bHLH 转录因子家族的PIFs 可以通过与远红光吸收型光敏色素互作来调控植物开花，其中，PIF4 和PIF5 的表达具有节律性，可能通过与节律钟基因的相互作用来调控植物的生长和开花[21]。受光照激活的光敏色素既可以通过光诱导的磷酸化作用与PIFs 蛋白互作，也可与其直接互作，诱导PIFs 蛋白迅速降解[22-24]。同时光敏色素还可以通过调控COP1 （ constitutivelyphotomorphogenic 1）-SPA（suppressor of phytochromeA）复合体的活性，间接影响PIFs 蛋白的稳定性[25-26]，降低PIFs 的表达水平。PIFs 能够结合生物钟的核心组件CCA1/LHY 启动子的G-box 区域，参与生物钟的调节[27]。本研究发现PhPIF4 基因编码的氨基酸具有bHLH_SF superfamily（cl00081）同源异型盒家族的典型保守结构域，bHLH 家族是植物中第二大类转录因子家族，参与植物不同组织众多代谢过程的调控，在植物光信号传导、抗逆胁迫和次生代谢等过程中发挥重要作用。本研究发现PhPIF4 与蝴蝶兰花发育过程紧密相关，随着花发育其表达量逐渐加倍，但其与光敏色素和节律钟基因的互作关系有待进一步研究验证。

生长调节剂可影响蝴蝶兰成花转变。赤霉素被认为是促进蝴蝶兰花芽分化与花期提前最重要的生长调节剂[28-29]。郑锦凯等[30]研究发现250、500、1000 mg/mL 赤霉素处理后蝴蝶兰花期分别提前了5、9、17 d。此外，GA 可有效提高蝴蝶兰双梗率、花芽分化率和分枝率[31]，可代替环境信号来缩短植物的开花时间。BLANCHARD 等[32]研究发现单独喷施200 mg/L 或400 mg/L BA（0.2 L/m²）的植株比未处理的植株早3～9 d 出现明显的花序，平均每株多0.7～3.5 个花序、多3～8朵花，但BA 不能完全替代低温诱导。BA+GA 处理对不同速率下的花序数和总花数均无显著影响。刘晓荣[31]研究发现蝴蝶兰大花品种2048 对植物生长调节剂较小花品种如满天红更敏感，10 mg/L 6-BA 显著增加了花芽分化速度， 而25 mg/L 与对照差异不显著。涂抹花芽处理试验中，25 mg/L 和50 mg/L 6-BA、50 mg/L GA 均提高了双梗率。因此不同激素联合处理蝴蝶兰的成花作用效果在品种间存在差异。本研究仅针对大辣椒品种展开试验，发现GA3 处理增加了花梗长度，并使花期提前。6-BA 可显著增加蝴蝶兰花量，但对花期和花梗长度无显著作用。2 种激素联合使用效果介于二者之间。

植物成花过程赤霉素信号转导通路主要包括GID1、DELLA蛋白以及介导DELLA蛋白降解的其他调控因子。当GA 在细胞外的浓度较高时，GA 上的C 端结构域会与GID1 结合，从而引发一系列相关应答反应；当细胞外GA 浓度低时，GA则不与GID1 结合，这时GA 应答基因与DELLA蛋白结合，并被其抑制活性[33]。拟南芥PIF1 能够与2 个DELLA 蛋白基因RGA1 和GAI 的启动子结合抑制黑暗中种子萌发[34]。拟南芥DELLA蛋白通过抑制PIF4 的活性，调节植物开花时间，在缺乏DELLA 蛋白时植物会表现出提前开花的表型[35]。GA 降解DELLA 蛋白，在GA 缺乏的植株中，DELLA 蛋白积累，PIF4 的活性被抑制，抑制FT 相关基因的表达，导致开花延迟[36]。本研究中，喷施生长调节剂GA3 后，PhPIF4 基因在花芽、叶和根中的表达量均有所增加，且在FB 期表达量最大，表明PhPIF4 基因的表达可能受GA3影响与调控。但赤霉素是直接调控PhPIF4，还是通过赤霉素调节DELLA 蛋白含量，使DELLA 蛋白与PIF4 蛋白互作，进而间接调节PhPIF4 的表达量，仍有待进一步研究。

PIF 基因在植物生长发育中起到“枢纽”作用[37]，本文研究了GA3 等生长调节剂对蝴蝶兰生殖生长的影响，探究了PhPIF4 基因响应赤霉素的表达情况，为揭示其在蝴蝶兰生长发育过程中的作用奠定基础，进一步完善PhPIF4 在赤霉素调控生长发育的调控网络，为其遗传育种应用做准备。