Th9细胞及其细胞因子对于乙型肝炎肝纤维化程度的诊断效能

王兰 邱红 朱月蓉 顾畅 张薇薇 杨帆

免疫介导的肝损伤是HBV感染后的一个重要致病因素,CD4+T淋巴细胞(如Th1、Th2和Th17细胞)的不充分应答可以导致HBV持续感染[1]。Th9细胞作为近年来被发现的新型CD4+辅助性T细胞,通过与其他T细胞亚群交互作用,发挥促炎/抗炎功能[2]。Th9细胞已被证实参与了多种免疫介导的炎性疾病,如:末梢神经炎、过敏性疾病、结直肠炎等等,但同时也延缓了肿瘤的进展[3-6]。越来越多的文献报道Th9及相关细胞因子参与了肝脏的慢性损伤过程,包括肝纤维化、急性肝衰竭等等[7-10]。

本研究探讨了Th9细胞及相关细胞因子在HBV感染后不同肝纤维化分期患者体内的变化及其在乙型肝炎肝纤维化过程中的诊断价值。

资料与方法

一、一般资料

选取2021年1月至12月在东部战区总医院秦淮医疗区就诊的慢性HBV感染者207例,其中男性108例,女性99例,年龄(40.4±8.8岁)。诊断标准根据《慢性乙型肝炎防治指南(2019年版)》[11]。纳入标准:①符合慢性HBV感染诊断标准;②HBV感染史≥6个月;③行肝组织病理活检。排除标准:①合并其他肝炎病毒、HIV、EBV感染者;②合并自身免疫性肝炎、酒精性肝病、肝硬化等;③接受核苷(酸)类药物或干扰素抗病毒治疗者;④合并恶性肿瘤者。

二、研究方法

西门子ADVIA 2400型全自动生化分析仪检测受试者生化指标;ADVIA 2120型全自动血细胞分析仪检测血常规。

相关无创诊断模型计算公式为:FIB-4=(年龄(岁)×AST(U/L))/(PLT(109/L)×ALT(U/L)1/2),APRI=AST/ULN×100/PLT(109/L),AAR=AST(U/L)/ALT(U/L),RPR=RDW(%)/PLT(109/L)。

外周血IL-9及Th9细胞水平检测:采用ELISA法检测各组受试者血清IL-9含量,具体实验步骤按ELISA试剂盒说明书进行。取100 μL外周血,采用平衡密度梯度离心法分离外周血单个核细胞,分离细胞用50 ng/mL(12-)十四酸佛波酯(-13-)乙酸盐(PMA),1 μg/mL离子霉素,2 μmol/L蛋白转运抑制剂37°C刺激4 h,然后加入IL-9A-PE及IL-17A-FITC抗体共孵育20 min,磷酸盐缓冲液洗涤重悬后上机检测。CD3+CD8-为CD4+T细胞,其中IL-9+IL-17-定义为Th9细胞。

三、统计学分析

结 果

一、不同肝纤维化程度组临床一般资料比较

根据受试者肝脏穿刺活检及病理学检查的结果,以Scheuer评分系统界定为S0(31例)、S1(33例)、S2(44例)、S3(56例)、S4(43例)五期。S0为无纤维化组,S1～S2为轻中度纤维化组,S3～S4为重度纤维化组,各组性别及年龄构成均无明显差异(P>0.05)。

无纤维化组、轻中度纤维化组及重度纤维化组比较,ALT及AST水平差异无统计学意义(P>0.05);FIB-4、APRI、AAR、RPR差异均有统计学意义(P<0.01)。见表1。

表1 不同肝纤维化程度组ALT、AST、FIB-4、APRI、AAR、RPR、GPR比较[M(P25, P75)]

二、不同肝纤维化程度组外周血IL-9及Th9细胞水平

无纤维化组、轻中度纤维化组及重度纤维化组比较,IL-9及Th9细胞水平差异均有统计学意义(P<0.01)。见表2。

表2 不同肝纤维化程度组外周血IL-9及Th9细胞水平比较(±s)

三、外周血IL-9及Th9细胞水平与肝纤维化分期的相关性

ALT、AST水平与肝纤维化分期无明显相关性(r=-0.053、0.122,P=0.522、0.138); FIB-4(r=0.740,P<0.01)、APRI(r=0.581,P<0.01)、AAR(r=0.379,P<0.01)、RPR(r=0.714,P<0.01)与肝纤维化分期呈正相关;外周血IL-9(r=0.396,P=0.009)及Th9细胞(r=0.421,P=0.002)水平与肝纤维化分期呈正相关。

四、各变量对肝纤维化程度的诊断效能

FIB-4、APRI、AAR、RPR、IL-9及Th9对乙型肝炎所致的轻中度及重度肝纤维化的诊断效能较好,FIB-4的诊断效能最高,其AUC分别为0.878(轻中度组)和0.831(重度组);在轻中度肝纤维化组中,FIB-4的敏感度最大,说明其漏诊率最低,而APRI的特异度最大,即误诊率最低。在重度肝纤维化组中,FIB-4的漏诊率依旧最低,RPR的误诊率最低。见表3。

表3 各变量对不同程度肝纤维化的诊断效能分析

五、IL-9、Th9、FIB-4、RPR对肝纤维化程度的联合诊断效能

在对IL-9、Th9、FIB-4、RPR四个指标联合诊断效能的比较中发现,联合各变量可以提高对乙型肝炎所致肝纤维化的诊断效能,其中IL-9+Th9+FIB-4联合对轻中度肝纤维化的诊断效能最佳(AUC=0.934),IL-9+Th9+FIB-4+RPR联合对重度肝纤维化的诊断效能最佳(AUC=0.943)。同时,IL-9+Th9+FIB-4+RPR联合诊断肝纤维化的敏感度最大,即漏诊率最低;IL-9+Th9+RPR联合诊断的特异度最大,即误诊率最低。见表4。

表4 各指标联合诊断不同程度肝纤维化的效能

讨 论

HBV感染后宿主的免疫应答状态对疾病进程及病毒的清除及疾病转归至关重要[12]。研究显示,肝星状细胞激活及细胞外基质的异常堆积导致了肝纤维化的发生,CD4+辅助性T细胞(Th cells)和调节性T细胞(Tregs)在此过程中发挥了重要作用。Th细胞可以通过其产生的细胞因子调控炎性反应的强度及持续时间,已被证实的有Th1/Th2细胞及Treg/Th17细胞失衡将导致肝损伤及纤维化的发生等。作为一类新发现的Th细胞,Th9细胞可分泌IL-9及IL-10。IL-9作为其主要的效应因子,可以通过调节Treg 和/或Th17细胞的发育及功能来发挥促炎/抗炎作用[13-14]。近年来,已证明Th9细胞参与了多种疾病进程,如过敏性疾病、自身免疫病、肿瘤、器官移植及寄生虫感染等,且IL-9与呼吸道合胞病毒及EB病毒感染、肺纤维化、囊性纤维化等纤维化疾病相关联[1-2]。有学者发现,HBV感染者体内的IL-9水平较健康人群明显升高[8],但Th9细胞在HBV感染后肝纤维化过程中是否发挥作用尚无明确答案。

目前常用于评估乙型肝炎肝纤维化程度的无创诊断指标包括FIB-4、APRI、AAR、RPR等。本研究结果显示,随着肝纤维化程度的加重,FIB-4、APRI、AAR、RPR以及外周血IL-9及Th9细胞水平亦趋于升高并与HBV感染者的肝纤维化程度呈正相关;提示Th9细胞增殖及IL-9分泌增加可能参与了肝纤维化的发生发展。有文献报道,敲除IL-9的肝纤维化模型小鼠脾脏中Th9、Th17及Th1水平均有所下降,同时IL-17A、IFN-γ、TGF-β 1, IL-6等促炎因子也表达下调,均提示IL-9可能在肝纤维化过程中起到了调节炎症反应的作用。Qin等[8]研究发现,肝硬化患者末梢血中的大量Th9细胞均高表达CCR4及CCR6趋化因子受体,而肝组织中α-平滑肌肌动蛋白、CCR6及CCL20的表达均明显上升,说明大量的肝星状细胞(HSCs)被活化,最终导致肝硬化的发生。

为确定Th9细胞及IL-9在肝纤维化分期中的诊断效能,进一步分析发现,IL-9及Th9对乙型肝炎所致的轻中度及重度肝纤维化均具备较好的诊断效能,敏感度较高,但特异度较差。将IL-9、Th9、FIB-4、RPR 4项指标联合诊断可以不同程度提高对乙型肝炎所致肝纤维化的诊断效能,其中IL-9+Th9+FIB-4联合对轻中度肝纤维化的诊断效能最佳,IL-9+Th9+FIB-4+RPR联合对重度肝纤维化的诊断效能最佳;IL-9+Th9+FIB-4+RPR漏诊率最低;IL-9+Th9+RPR误诊率最低。

综上所述,Th9细胞及IL-9水平在HBV感染后肝纤维化患者外周血中均有不同程度的升高,并与肝纤维化程度呈正相关性;与FIB-4、RPR联合,可提高评估乙型肝炎所致肝纤维化程度的敏感度和特异度,为临床后续治疗提供参考依据。

利益冲突声明:所有作者均声明不存在利益冲突。