丹皮酚对肿瘤坏死因子α诱导人星形胶质细胞神经损伤模型的保护机制研究

秦劭晨,王爱梅,万晓波

(1山西中医药大学附属医院·山西 太原 030024;2太原市中医医院·山西 太原 030009)

偏头痛作为一种普遍而复杂的神经性疾病,主要症状为单侧或双侧头部的搏动样疼痛,反复发作,迁延不愈,常伴有恶心、呕吐和畏光等症状[1]。偏头痛在发生发展过程中会诱发严重的中枢炎症反应[2]。补阳还五汤具有益气补血、活血通络的效果,对于气虚血瘀偏头痛患者具有良好的临床疗效[3],但其具体作用机制尚不明确。作为补阳还五汤中佐药之一的赤芍有效成分之一丹皮酚(Paeonol,Pae),具有镇痛、抗炎、保护神经系统等作用[4],但在偏头痛中的作用机制尚不明确。本研究采用肿瘤坏死因子α(TNF-α)刺激人星形胶质细胞,构建体外炎症性神经损伤模型,研究Pae对体外炎症性神经损伤模型的保护作用。

1 实验材料

1.1 实验细胞 人星形胶质细胞株(HA1800)购自中科院细胞库。

1.2 实验药物与试剂 Pae:上海吉至生化科技公司,货号:C64600-50mg;地塞米松(DEX):上海麦克林生化科技公司,D917754。TNF-α:北京科兴生物科技公司;NO、 MDA、LDH和SOD试剂盒:南京建成生物工程研究公司;TRIZOL:碧云天生物公司;引物:英潍捷基生物工程有限公司设计合成。Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒:中国上海贝博生物科技公司;IL-1β、IL-18ELISA试剂盒:美国SAB公司;NLRP3和caspase-1ELISA试剂盒:美国Abcam公司;PrimeScriptTMRT reagent kit, TB Green®Premix Ex TaqTMII:Takara生物公司。DMEM培养基:中国Macklin公司;胎牛血清(FBS):澳大利亚Moregate公司。

1.3 实验仪器 细胞培养箱:美国Eppendorf公司;倒置显微镜:日本尼康公司;BT25S电子分析天平:德国Sartorius科技有限公司;PIKOREAL 96荧光定量PCR仪:美国Thermo Scientific公司;SORVALL Biofuge fresco冷冻离心机:德国Kendro Labrotary公司;Varioskan LUX多功能酶标仪:美国Thermo Fisher公司; Attune CytPix成像型流式细胞仪:美国Thermo Fisher公司。

2 实验方法

2.1 实验分组 取对数生长期的HA1800细胞,分为正常组(NC)、模型组(TNF-α 10 μg/L)、Pae各浓度组和阳性药对照组(DEX,10μmol/L)。

2.2 观察指标

2.2.1 CCK8检测Pae对HA1800细胞活力的影响 取对数生长期的HA1800细胞接种于96孔板中(密度:5 000个/孔),12 h后去除培养上清加入终浓度为1.00、6.25、12.50、25.00、50.00、100.00、200.00 μmol/L的Pae刺激24 h后,加入CCK8孵育30 min,450 nm波长酶标仪检测各孔光密度(OD)值。所有实验重复不少于3次,取平均值。

2.2.2 分光光度法检测细胞上清液NO、MDA、LDH和SOD水平 取对数生长期的HA1800细胞种于6孔板中(密度:2×105个/孔),在37 ℃、5% CO2的培养箱中培养12 h,正常组加入DMEM,除正常组外,各组均加入TNF-α(10 μg/L)刺激24 h,给药组加入Pae(50 μmol/L)作用24 h,阳性对照组加入Dex(10 μmol/L)作用24 h,收集细胞上清液,根据试剂盒说明书操作。所有实验重复不少于3次,取平均值。

2.2.3 ELISA检测细胞上清液IL-1β、IL-18、NLRP3、caspase-1水平 将HA1800细胞种于12孔板中(密度:5×104个/孔),在37 ℃、5% CO2的培养箱中培养12 h,细胞造模给药方法参照2.2.2,收集细胞后加入Tirzol裂解液,提取RNA,-80℃冻存备用。收集细胞上清液,根据试剂盒说明书操作。所有实验重复不少于3次,取平均值。

2.2.4 RT-PCR检测细胞IL-1β、IL-18、NLRP3、caspase-1的mRNA 表达 取2.2.3备用的RNA,根据TAKARA逆转录试剂盒说明书逆转录成cDNA。Gene Bank数据库中检索引物,由英潍捷基生物工程有限公司设计合成。所有引物序列见表1。按照PCR扩增试剂盒说明书扩增cDNA。PCR反应体系的总体积为18μL。以95℃预变性5 min,95℃变性10 s,60℃退火30 s,95℃延伸15 s,共42个循环为反应条件。计算结果用GAPDH标化目的基因的相对表达,通过2-ΔΔCt对目的基因进行定量。

表1 PCR引物序列

2.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡率 取对数生长期的HA1800细胞种于6孔板中(密度:2×105个/孔),在37 ℃、5% CO2的培养箱中培养12 h,细胞造模给药方法参照2.2.2。给药结束后收集各孔细胞用预冷PBS离心洗涤,取400 μL 1× Annexin V结合液重悬细胞,细胞浓度2×105个/mL。5 μL Annexin V-FITC染色液加入细胞悬液,轻轻震荡混匀,在2～8 ℃避光环境孵育15 min。加入PI染色液(10 μL)轻轻震荡混匀,在2～8℃避光环境孵育5 min。最后,流式细胞仪检测凋亡率。

3 结果

3.1 Pae对HA1800细胞活力的影响 各浓度的Pae作用于HA1800细胞,浓度在25.00～100.00 μmol/L对HA1800细胞均有明显增殖作用,其中50.00 μmol/L、100.00 μmol/L的Pea对HA1800细胞增殖作用最明显(P<0.01),结果见表2。

表2 各浓度Pae对星形胶质细胞活力的影响

3.2 Pae对TNF-α诱导的HA1800细胞活力的影响 见表3。

表3 各浓度Pae对TNF-α诱导的HA1800细胞活力的影响

3.3 Pae对TNF-α诱导HA1800细胞神经损伤模型NO、MDA、LDH、SOD表达的影响 见表4。

表4 各组细胞上清液NO、MDA、LDH、SOD测定结果比较

3.4 Pae对TNF-α诱导的HA1800细胞神经损伤模型IL-1β、IL-18、NLRP3、Caspase-1表达水平的影响 见表5～表6。

表5 各组HA1800 细胞IL-1βmRNA、IL-18 mRNA、NLRP3 mRNA和Caspase-1 mRNA表达的比较

表6 各组HA1800 细胞培养上清液IL-1β、IL-18、NLRP3和Caspase-1含量比较

3.5 Pae对TNF-α诱导HA1800细胞神经损伤模型细胞凋亡的影响 见表7。

表7 各组HA1800 细胞凋亡率比较

4 讨论

偏头痛作为一种神经性炎症疾病,其发病机制复杂,症状反复迁延难愈,补阳还五汤对于气虚血瘀型偏头痛患者具有良好的临床疗效[5],其佐药赤芍具有活血通络的作用,Pae作为赤芍的有效成分,有良好的抗炎、抗氧化等药理作用[6],本研究采用TNF-α刺激HA1800细胞的构建体外炎症性神经损伤模型,探讨Pae对于HA1800细胞的炎症性神经损伤状态下的保护作用。

中枢神经系统的胶质细胞有星形胶质细胞和小胶质细胞,与神经元密切连接的星形胶质细胞,可支持和营养神经元;同时,因其与脑血管广泛接触,还可调节大脑血流量[7],由此,星形胶质细胞在神经系统中起着重要作用。研究发现,在神经炎症环境下可激活大脑中的神经胶质细胞,释放出炎性细胞因子激活神经元,这些炎症因子成为参与神经性疼痛的介质,引起痛觉反应[8]。因此,炎症环境下的星形胶质细胞与偏头痛关系密切。

有研究提出三叉神经-内耳神经血管的功能失调学说,指出刺激三叉神经节和纤维使内耳血流增加的同时肥大细胞活化,最后释放炎性介质、神经致敏物质等,产生炎症反应,从而刺激痛觉纤维产生疼痛并传入中枢,引起偏头痛[9]。近年来神经性偏头痛中的炎症反应受到越来越多的关注,IL-1β、IL-18、NLRP3等炎症介质的释放可引发神经损伤的同时加重疼痛[10]。

细胞焦亡是一种不同于凋亡和坏死性凋亡的程序化炎症性细胞死亡过程,表现为细胞肿胀、膜起泡、DNA断裂和最终细胞裂解,然而,焦亡细胞核通常保持完整,这与中观察到的细胞核破坏现象不同[11]。NLRP3炎症小体的激活导致caspase-1活化,caspase-1活化后一方面切割gasdermin(GSDMD),形成含有GSDMD 氮端活性域的肽段,诱导细胞膜穿孔,细胞破裂,释放内容物,引起炎症反应;另一方面,活化的caspase-1可切割IL-1β前体、IL-18前体,形成成熟的IL-1β和IL-18,释放到细胞外,招募炎症细胞聚集,扩大炎症反应,最终发生细胞焦亡[12-13]。而炎症反应与偏头痛又有密切联系,因此,本研究采用TNF-α刺激HA1800细胞,构建体外炎症性神经损伤模型,研究Pae对体外炎症性神经损伤模型的保护作用。结果发现,TNF-α刺激HA1800细胞,造成体外炎症性神经损伤后,出现IL-1β、IL-18、NLRP3和caspase-1表达水平上调,细胞活力被抑制,凋亡率上升,经Pae干预后IL-1β、IL-18、NLRP3和caspase-1表达水平明显下调,细胞活力有所改善,凋亡率下调。提示,Pae可能通过抑制HA1800细胞焦亡从而起到抑制神经炎症改善偏头痛的作用。

体内氧化应激(oxidative stress,OS)会导致炎症性疾病的加剧[14]。有研究表明,氧化应激水平增高会加剧神经炎症,而神经炎症与偏头痛密切相关[15]。此外,大量研究结果提示偏头痛患者外周血中氧化应激水平增高[16],然而目前关于氧化应激与偏头痛相关的具体机制尚不明确。本研究发现,TNF-α刺激HA1800细胞,造成体外炎症性神经损伤后,NO、MDA、LDH水平上调,SOD水平下调,Pae干预后,NO、MDA、LDH水平下调,SOD水平上调,提示Pae可改善TNF-α诱导的星形胶质细胞氧化应激状态。

综上所述,本研究发现,在TNF-α刺激的HA1800细胞体外炎症性神经损伤模型中,Pae对可下调IL-1β、IL-18、NLRP3和caspase-1等细胞焦亡相关的炎症介质的过度分泌,改善氧化应激反应,提示Pae可能通过抑制星形胶质细胞焦亡状态从而抑制神经炎症改善偏头痛的作用。Pae是补阳还五汤的主要有效成分,补阳还五汤对于偏头痛患者有良好的临床疗效,推测在偏头痛患者中补阳还五汤可通过其有效成分Pae抑制星形胶质细胞焦亡,减轻炎症反应,从而达到改善神经炎症缓解偏头痛的作用,但其具体作用机制还需进一步深入研究。