健脾宁神颗粒对抽动障碍小鼠脑内氨基酸类神经递质的影响

尤士军,梁 雪,李会影,刘建璇,庄玲伶,仇志锴,于映霞

(吉林省中医药科学院·吉林 长春 130021)

抽动障碍(tic disorders,TD)是儿童常见疾病,有学者认为单胺类递质失衡可导致抽动障碍的发生,也有学者认为脑内氨基酸类神经递质异常与抽动障碍的发生有关[1]。随着中药在抽动障碍治疗上的不断创新,本院基于“以静制动”法研发的治疗儿童抽动障碍的医院制剂“健脾宁神颗粒”临床应用于TD的治疗有效率达80%以上[2]。本研究旨在探讨健脾宁神颗粒对抽动障碍小鼠脑内氨基酸类神经递质的影响,旨在为临床治疗提供实验室依据。

1 实验材料

1.1 实验动物 ICR 小鼠,雄性,SPF级,体质量 (18±2)g,由辽宁长生生物技术股份有限公司提供,许可证号:SCXK(辽)2020-0001。动物饲养于吉林省中医药科学院动物室(SPF级),实验动物使用许可证号:SYXK(吉)2022-0004。

1.2 药物与试剂 健脾宁神颗粒,处方包含:石决明、石菖蒲、郁金、白芍、甘草、半夏、伸筋草、太子参、茯苓等药材,由吉林省中医药科学院制剂室提供,3.43 g生药/g。盐酸硫必利:江苏恩华药业股份有限公司生产,国药准字 H32025477。亚氨基二丙腈(IDPN)及谷氨酸、天门冬氨酸、γ-氨基丁酸标准品:均购自美国 Sigma 公司。

1.3 主要仪器 T1600 电子天平:美国双杰兄弟集团有限公司;HC-3618R高速冷冻离心机:安徽中科中佳科学仪器有限公司;LC-2010A-HT高效液相色谱仪:日本岛津。

2 实验方法

2.1 动物造模 取健康ICR小鼠60只,适应性喂养1 周后,开始实验。正常对照组(10只) 小鼠腹腔注射生理盐水,其余各组小鼠均腹腔注射亚氨基二丙腈(IDPN)造模[3]。将IDPN溶于生理盐水配制成为浓度为 22 g/L的溶液,每只小鼠每天按 350 mg/kg的剂量腹腔注射 IDPN溶液,连续注射7 d。造模后,将小鼠单独放置于观察笼内,室内环境保持安静,避光,并排除其他干扰,适应环境 5 min 后,开始记录小鼠的行为学变化。小鼠出现不同程度的刻板行为和运动行为,尤其是在安静状态下,行为学改变明显,安静时间明显缩短,提示抽动障碍小鼠复制成功。

2.2 动物分组及给药 将50只造模成功小鼠,随机分为5组,即模型对照组,健脾宁神颗粒高、中、低剂量组和盐酸硫必利组,每组10只。正常对照组和模型对照组给予等体积生理盐水,健脾宁神颗粒高、中、低剂量组给药剂量分别为45.56、22.78、11.39 g/kg,盐酸硫必利组给药剂量为25 mg/kg,各组小鼠均为口服灌胃给药,每日给药1次,连续给药4周。

2.3 观察指标及测定 给药结束后24 h,快速脱臼处死小鼠,取脑,-80 ℃冰箱冻存脑组织。检测指标前,取脑组织置于离心管中,加入 0.4 mmol/L高氯酸3 mL,匀浆 7 min,置于离心机离心(10 000 r/min),离心10 min,取上清备用。衍生化反应:取250 μL上清液置于10 mL离心管中,加入曲唑酮40 μL,KHCO3100 μL,丹酰氯200 μL, 80 ℃水浴反应 30 min．取出后再加入醋酸丙酮100 μL,冷却后过 0.23 μm的滤膜装样,进样量为20 μL,高效液相色谱仪测定脑组织 GLU、ASP、GABA 含量。

3 结果 见表1。

表1 各组小鼠脑组织 GLU、ASP、GABA 含量比较

4 讨论

近年来,抽动障碍(TD)在我国青少年中的发病率日益上升,因此,充分认识 TD 的发病机制及探讨中药治疗抽动障碍的作用机制对于控制抽动障碍的发生意义重大[3]。TD的发病与多种因素有关,有学者认为单胺类递质失衡可导致抽动障碍的发生,也有学者认为,氨基酸是影响儿童生长、发育、成熟的重要物质,其脑内氨基酸类神经递质异常与抽动障碍的发生有关。氨基酸类神经递质异常包括兴奋性神经递质及抑制性神经递质。其中,GLU和 ASP是中枢神经系统中主要的兴奋性神经递质,GABA是主要的抑制性神经递质。有研究显示脑组织中兴奋性氨基酸和抑制性氨基酸含量的失衡可能是引起抽动障碍的原因之一[4-5]。

传统中医将TD归属于“筋惕”“惊风”“肉瞤”等范畴,认为该病的发生与心火、肝木、脾土、肾水、肺金等脏腑五行失衡有关[6-7]。本院儿科根据治疗(脾虚肝亢型)抽动障碍患儿的临床经验,总结出健脾宁神汤经验方,主要包括石决明、石菖蒲、郁金、白芍等药味,具有以静制动、健脾息风之功效。

本研究通过腹腔注射 IDPN溶液,复制小鼠的抽动障碍模型,7 d后,模型小鼠出现不同程度的刻板行为和运动行为,尤其是在安静状态下,行为学改变明显,安静时间明显缩短,提示抽动障碍小鼠复制成功。连续给药4周发现,健脾宁神颗粒高、中、低剂量组及阳性对照组小鼠脑组织中 GLU、ASP含量与模型对照组比较明显降低,GABA 含量明显升高,差异具有显著的统计学意义(P<0.01)。提示:健脾宁神颗粒治疗抽动障碍可能的机制之一是维持兴奋性氨基酸类神经介质和抑制性氨基酸类神经介质的动态平衡。