参芪地黄汤含药血清对脂多糖诱导人肾小球内皮细胞损伤的保护作用及机制研究

徐晨希,严浩军,刘芙蓉,张树明

(黑龙江省中医药科学院·黑龙江 哈尔滨 150036)

参芪地黄汤由六味地黄丸化裁(去泽泻加人参、黄芪、姜枣)而来,出自《杂病源流犀烛》,具有益气养阴、健脾补肾功效,为脾肾双补代表方。在慢性肾脏疾病的治疗中有广泛应用并取得较好的临床疗效[1-2]。研究表明,参芪地黄汤方药可有效降低慢性肾脏疾病患者的血肌酐、尿素氮、尿白蛋白水平,增加肾小球滤过率[1,3];能够抑制DKD患者的炎症反应,保护肾小球内皮细胞[3-4];抗氧化应激及防止肾脏纤维化[5];改善糖代谢紊乱[6]。

脂多糖(LPS)是一种内毒素,由脂质和多糖构成,与TLR4炎症小体结合后可刺激与炎症相关的NF-κB(Nuclear Factor Kappa-B)通路活化,进而导致一系列炎症反应。GS-5829是一种新型的BET抑制剂,可抑制NF-κB通路的信号传导,减轻机体炎症反应[7]。本实验旨在研究参芪地黄汤含药血清对LPS诱导的人肾小球内皮细胞损伤的保护作用并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞株及动物 人肾小球内皮细胞(HRGEC):购于上海艾睿生物科技有限公司。实验动物:健康SPF级5周龄雄性Wistar大鼠,体质量(200±20)g,购于哈尔滨医科大学实验动物学部,合格证号:SCXK(黑)2019-001。大鼠于25℃、湿度60% GLP实验室饲养。

1.2 药品与试剂 参芪地黄汤(党参、黄芪、熟地黄、茯苓、丹皮、山茱萸、山药、生姜、大枣)中药饮片购于北京同仁堂哈尔滨香坊店;GS-5829:美国Selleck公司,货号S896101。LPS:北京博奥拓达科技有限公司,货号L-2880;CCK-8试剂:上海碧云天生物技术有限公司,货号C0039;ANNEXIN V-FITC/PI凋亡试剂盒:北京索莱宝科技有限公司,货号CA1020;NO检测试剂盒:上海碧云天生物技术有限公司,货号S0021;Human TNF-α ELISA试剂盒:武汉博士德生物工程有限公司,货号EK0525;DMEM培养基:美国Gibco公司,货号C11995500BT;胰酶:美国Gibco公司,货号25200-056;胎牛血清:浙江天杭生物科技股份有限公司,货号11012-8611。

1.3 主要实验仪器 M200多功能酶标仪:奥地利TECAN公司;FACSCalibur流式细胞仪:美国BD公司;MYSPIN-12迷你离心机:美国Thermo Fisher Scientific公司;ST-16R型低温高速离心机:美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.4 大鼠血清制备 参芪地黄汤方药组成:党参6 g、黄芪15 g、熟地黄15 g、茯苓9 g、丹皮9 g、山茱萸9 g、山药15 g、生姜3片、大枣2枚,按照人临床剂量的5倍量换算为大鼠给药剂量。方药提前浸泡半小时,用1 000 mL水煎煮40 min后再加入1 000 mL水煎煮20 min,合并煎煮液并浓缩至含生药浓度2.34 g/mL。按每次5 mL/kg大鼠灌胃给予参芪地黄汤方浓缩液,3次/日,连续灌胃7 d。空白组连续7 d灌胃等剂量生理盐水。腹主动脉采血,收集血液至真空采血管内,处理后取上清,-20 ℃保存。

1.5 细胞培养及分组 将HRGEC培养于25 mL细胞培养瓶内,置于含有5%CO2、37 ℃恒温培养箱内培养,当细胞铺满80%～90%时传代。每10 mL完全培养基包含:1 mL胎牛血清,9 mL DMEM基础培养基,外加1%青霉素-链霉素溶液。将细胞分为5 组:①正常组:用完全培养基培养细胞;②模型组:用含10 mg/L LPS浓度的完全培养基培养细胞;③含药血清组:用含10%参芪地黄汤含药血清及10 mg/L LPS浓度的完全培养基培养细胞;④空白血清组:用含10%大鼠空白血清及10 mg/L LPS浓度的完全培养基培养细胞;⑤阳性对照组:用含10 μmol/L GS-5829及10 mg/L LPS浓度的完全培养基培养细胞。

1.6 观察指标及测定

1.6.1 细胞增殖测定 选择处于对数生长期的HRGEC,在96孔板中接种细胞悬液,每孔100 μL,3 000个/孔。将96孔板置于细胞培养箱中培养4～6 h,贴壁后弃去培养基,加入LPS及其与药物的混合溶液,该混合溶液中LPS的终浓度为10 mg/L;阳对药GS-5829终浓度为10 μmol/L。空白组加入等量DMEM培养基,分别培养12、24、48 h。每孔加入CCK-8溶液10 μL,3 h后测定OD值,计算细胞增殖率。细胞增殖率=(待测组OD值-调零孔OD值)/(空白组OD值-调零孔OD值)×100%

1.6.2 流式细胞术检测细胞凋亡 将已经培养24 h的各组HRGEC用胰酶处理分别收集,1 000 r/min离心5 min,将各组细胞制作成1×106个/mL的单细胞悬液1 mL备用。每管中加入100 μL细胞悬液,5 μLAnnexinⅤ-FITC,室温避光,轻轻混匀,10 min后加入5 μL PI,室温避光孵育5 min,加PBS溶液至500 μL,1 h内使用流式仪检测。

1.6.3 NO含量测定 将细胞培养于24孔板中,待细胞贴壁后弃去上清,使用PBS润洗3遍,加入LPS与药物的混合溶液培养24 h后取细胞上清液离心,硝酸还原酶法检测NO含量,操作均严格按照说明书进行。

1.6.4 ELISA法测定TNF-α含量 细胞培养方法同1.6.3,ELISA检测TNF-α含量,操作均严格按照说明书进行。

2 结果

2.1 不同时间参芪地黄汤含药血清对HRGEC细胞增殖的影响 见表1。

表1 不同时间各组HRGEC增殖率比较

2.2 参芪地黄汤含药血清对HRGEC细胞凋亡的影响 见图1,表2。

图1 各组HRGEC凋亡的流式细胞术检测结果

表2 各组HRGEC凋亡率的比较

2.3 参芪地黄汤含药血清对HRGEC NO、TNF-α含量的影响 见表3。

表3 各组HRGEC NO、TNF-α含量比较

3 讨论

在进行细胞增殖及凋亡实验时,不同的细胞大小、生长速度不同,因此需考察HRGEC贴壁时间、倍增时间、不同接种数下的细胞生长曲线,以此选择最佳时间及细胞接种数。当HRGEC培养至12 h时,状态良好,但此时处于细胞生长停滞期内(细胞传代后有一个16 h左右的停滞期),细胞密度较小;培养至24 h时,细胞状态良好,此时细胞处于对数生长期早中期内,细胞密度适中,生长力旺盛,适合此时进行实验;细胞培养至48 h时,显微镜下可见细胞密度较大,此时进行实验会导致本底值较高,且细胞易漂浮,重悬后易成团,提示此时细胞状态变差。从细胞增殖率结果来看,随时间延长,LPS对细胞的损伤加剧,细胞增殖率不断下降,各时间段与空白组均有显著差异,在24 h时细胞凋亡率适中,因此选择24 h即细胞处于对数生长早中期时进行实验。

细胞凋亡在生物体的进化、内环境的稳定以及多个系统的发育中起着重要的作用。已有研究表明,参芪地黄汤的主要成分黄芪多糖可修复LPS诱导的内皮祖细胞损伤,减轻LPS诱导的细胞凋亡[8];党参多糖可以通过抑制线粒体凋亡进而抑制体外糖尿病血管内皮细胞凋亡[9];山茱萸环烯醚萜苷可以促进血管内皮细胞增殖活性,抑制因高糖引起的细胞萎缩和凋亡[10]。以上研究均提示参芪地黄汤含药血清可能发挥药效的主要化学成分,同时也印证了本实验的结果:参芪地黄汤可以减轻细胞凋亡。

NO是人体关键信号分子,是以精氨酸为原料通过一氧化氮合酶催化而生成,分为内皮细胞型一氧化氮合酶(eNOS)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和神经元型一氧化氮合酶(nNOS)[11]。有研究表明,LPS可以使人脑微血管内皮细胞培养液中NO水平升高[12],该结果与本实验LPS可使HRGEC NO释放量增加的结果一致;参芪地黄汤含药血清可降低NO含量。

TNF-α是炎症反应过程中出现最早、最重要的炎性介质,能激活中性粒细胞和淋巴细胞,使血管内皮细胞通透性增加。黄芪甲苷可通过NF-κB/NLRP3信号通路降低人肺动脉内皮细胞TNF-α含量[13];党参多糖具可以通过抑制NF-κB信号通路减少炎症因子TNF-α的释放[14];山药蛋白可以减少内皮细胞TNF-α的释放,改善高糖诱导的内皮功能障碍[15]。本实验结果显示,参芪地黄汤具有减少炎症因子TNF-α释放作用。

综上,参芪地黄汤可减少LPS诱导的HRGEC凋亡,其作用机制可能与通过维持NO含量稳定保护血管内皮及减少TNF-α释放减轻炎症反应相关。