瑞芬太尼在子宫内膜癌细胞增殖及迁移中的调节机制及对miR-212-3p/LIN28B通路的影响

刘 洁,梅军华,张立成

(黄冈市中心医院,湖北 黄冈 438000)

子宫内膜癌是发生在子宫内膜的一组上皮恶性肿瘤,主要是由于刺激素过度刺激子宫内膜引起,且肥胖、高血压、月经初潮、不孕不育及卵巢疾病等均为该疾病高危因素[1-2]。Sugiura 等[3]研究表明:子宫内膜癌好发于绝经期及绝经后女性中,且70.0%～75.0%患者为绝经后女性,且随着人们生活方式改变,导致疾病发生率呈上升趋势,居妇科恶性肿瘤首位[4-5]。手术、放化疗是子宫内膜癌患者常用的治疗方法,但是患者5年生存率较低、预后较差[6]。瑞芬太尼属于是阿片类药物的一种,不仅能用于临床麻醉,亦可通过抑制Akt通路、调控B细胞淋巴瘤(B cell lymphoma,Bcl)-2相关蛋白,可抑制细胞的增殖、促进其凋亡,但是药物在子宫内膜癌中的作用效果研究较少。近年来,有报道[7]指出,多种微小RNA(microRNA,miRNA)能直接参与人类癌症的发病过程,miRNA可作为癌基因和肿瘤因子发挥作用。miRNA是一类大约19～24个核苷酸构成的非编码小RNA分子,通过靶向下游mRNA影响其转录或翻译,从而调控基因的表达。已有文献[8]报道,miR-212-3p参与各种肿瘤的发生和发展,且在胃癌、骨肉瘤等实体瘤中呈低表达,影响肿瘤细胞的迁移与侵袭,而LIN28B是其靶基因,在肝癌、宫颈癌等病灶组织中表达异常,能作为患者预后的生物指标[9]。本研究以子宫内膜癌Ishikawa细胞为研究对象,探讨瑞芬太尼在子宫内膜癌细胞增殖及迁移中的调节机制及对miR-212-3p/LIN28B通路的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料 子宫内膜癌Ishikawa细胞,购自于上海生化细胞研究所,并将其置于RPMI-1640培养基中,连续完成24 h培养,培养温度37 ℃,将最终获得的细胞放置在4个不同试管中,备用。Transwell小室,购自于美国Corning公司;Lipofcctaminc 2000购自于Invitrogcn公司;四甲基偶氮唑蓝,购自于美国Sigma公司;引物序列、miR-212-3p模拟物及抑制剂、LIN28B小干扰RNA等,均购自于广州锐博生物科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养、处理及转染:①细胞培养:取子宫内膜癌Ishikawa细胞,常规复苏后,加入10% FBS的RPMI1640培养基中,并将其置于37 ℃、5% CO2培养箱中,待细胞融合80.0%～90.0%时,加入胰蛋白消化。常规制成细胞悬液后,进行细胞传代培养。调整细胞浓度为2.5×104个/ml子宫内膜癌Ishikawa细胞,将其接种在6孔培养板中,连续完成24 h培养,备用[10]。②细胞处理:取子宫内膜癌Ishikawa细胞,随机将其放置在4个试管中,分别给予瑞芬太尼5、50、500 ng/ml的培养基连续完成24 h培养备用[11],以瑞芬太尼0 ng/ml为对照组。③细胞转染:取上述处理后的子宫内膜癌Ishikawa细胞,连续完成6 h转染,转染miR-NC、miR-212-3p mimics、si-NC及si-LIN28B,连续完成24 h干预,分别标记为:miR-NC组、si-NC组、si-LIN28B组;将转染anti-miR-NC和aiti-miR-212-3p的细胞采用500 ng/ml瑞芬太尼处理,并记为瑞芬太尼500 ng/ml+anti-miR-NC组和瑞芬太尼500 ng/ml+anti-miR-miR-212-3p组。采用实时荧光PCR法测定转染细胞中miR-212-3p水平,验证转染效果,并完成细胞收集、备用。

1.2.2 增殖抑制率检测:取各组处理后的子宫内膜癌Ishikawa细胞,将其接种在96孔板中,每孔细胞200 μl,连续完成12 h培养,并加入5 mg/ml的MTT溶液20 μl,37 ℃下进行72 h培养。加入二甲基亚砜(DMSO)150 μl,10 min孵育振荡,于24、48、72 h采用酶标仪在490 nm下完成吸光度值测定[12]。

1.2.3 miR-212-3p、LIN28B mRNA水平测定:取各组处理后的细胞,采用Trizol试剂完成细胞总RNA的提取,借助微量核酸仪完成RNA浓度提纯后,进行反转录,并进行PCR测定。借助实时荧光PCR法测定miR-212-3p、LIN28B mRNA水平,设定条件:95 ℃变性10 min,95 ℃变性15 s,60 ℃退火30 s,72 ℃下延伸30 s,连续完成循环45个,测定Ct值。以β-actin作为内参,采用2-△△Ct完成水平miR-212-3p、LIN28B mRNA测定[13]。

1.2.4 Cyclin D1、MMP-2、MMP-9及LIN28B蛋白测定:取上述细胞,完成总蛋白提取后,利用二喹啉甲酸(BCA)法检测蛋白浓度,待上述操作完毕后,采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。将获得的蛋白转移于聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,采用浓度为5%的脱脂牛奶常规下完成1 h封闭,4 ℃下加入细胞周期蛋白(Cyclin D1)、基质金属蛋白酶(MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)及LIN28B蛋白一抗孵育,洗膜后加入二抗,1 h孵育后加入显影剂,避光显影,借助全能型成像分析系统拍照,分析目标蛋白含量[14]。

1.2.5 迁移及侵袭检测:取上述处理后的子宫内膜癌Ishikawa细胞,将其接种在6孔板中,浓度为2.5×104个/ml,连续完成12 h培养后,去除培养基,整细胞浓度为1.0×105个/ml。①细胞迁移实验:取处理后细胞10 μl,放于Transwell小室内,保证细胞悬液100 μl,并加入含有500 μl 10%FBS的培养基,连续完成24 h培养后去除培养基,采用4%多聚甲醛连续完成15 min固定,0.1%结晶紫染色后显微镜下观察[15];②细胞侵袭实验:测定前在Transwell小室铺设基质胶,自然晾干后加入细胞悬液100 μl,其余操作同细胞迁移实验[16]。

2 结 果

2.1 四组子宫内膜癌Ishikawa细胞增殖抑制率比较 随着时间延长子宫内膜癌Ishikawa细胞增殖抑制率较为明显,四组24 h细胞增殖率比较无统计学差异(均P>0.05);且细胞增殖抑制率呈瑞芬太尼药物剂量依赖性(500 ng/ml瑞芬太尼细胞增殖抑制率最高)。见表1。

表1 四组子宫内膜癌Ishikawa细胞增殖抑制率比较(%)

2.2 四组子宫内膜癌Ishikawa细胞miR-212-3p、LIN28B mRNA及相关蛋白表达比较 四组不同浓度瑞芬太尼处理后miR-212-3p mRNA表达水平呈上升趋势(均P<0.05),而LIN28B mRNA水平呈下降趋势(均P<0.05),并呈剂量依赖性;Western Blot结果表明:四组Cyclin D1、MMP-2、MMP-9及LIN28B蛋白表达比较差异具有统计学意义(均P<0.05),随着瑞芬太尼药物剂量增加,其表达水平呈下降趋势。见表2。

表2 四组子宫内膜癌Ishikawa细胞miR-212-3p、LIN28B mRNA及相关蛋白表达比较

2.3 四组子宫内膜癌Ishikawa细胞迁移及侵袭情况比较 随着瑞芬太尼浓度增加,迁移细胞数与侵袭细胞数下降明显,并表现出剂量依赖;不同浓度细胞迁移与侵袭细胞数比较差异具有统计学意义(均P<0.05)。见表3。

表3 四组子宫内膜癌Ishikawa细胞迁移及侵袭情况比较(个)

2.4 子宫内膜癌Ishikawa细胞转染后细胞增殖、迁移及侵袭结果比较 miR-NC组细胞增殖抑制率低于miR-212-3p mimics(P<0.05),迁移细胞数、侵袭细胞数高于miR-212-3p mimics组(均P<0.05),见表4。

表4 子宫内膜癌Ishikawa细胞转染后细胞增殖、迁移及侵袭结果比较

2.5 抑制LIN28B蛋白对子宫内膜癌Ishikawa细胞增殖、迁移及侵袭的影响 抑制LIN28B蛋白后si-LIN28B组细胞增殖抑制率高于si-NC组(P<0.05);迁移细胞数、侵袭细胞数及LIN28蛋白表达水平均低于si-NC组(均P<0.05),见表5。

表5 抑制LIN28B蛋白对子宫内膜癌Ishikawa细胞增殖、迁移及侵袭的影响

2.6 抑制miR-212-3p对500 ng/ml瑞芬太尼处理后细胞活性的影响 瑞芬太尼500 ng/ml+anti-miR-212-3p组miR-212-3p、细胞增殖抑制率低于瑞芬太尼500 ng/ml+anti-miR-NC组(均P<0.05),LIN28B蛋白表达、迁移细胞数及侵袭细胞数高于瑞芬太尼500 ng/ml+anti-miR-NC组(P<0.05),见表6。

表6 抑制miR-212-3p对500ng/ml瑞芬太尼处理后细胞活性的影响

3 讨 论

子宫内膜癌属于女性生殖系统常见的恶性肿瘤,具有较高的发病率、致死率,对女性生命健康造成极大的威胁。Smith 等[17]研究表明:子宫内膜癌病因较多,药物、肥胖、生殖因素、糖尿病及饮食等,均会增加疾病发生率。目前,临床上对于子宫内膜癌以子宫切除手术、双侧输卵管卵巢切除术及盆腔淋巴结清扫术为主,借助手术虽然能切除病灶组织,但是远处转移或复发率较高。

阿片类药物在晚期癌痛的治疗中使用较多,而瑞芬太尼是芬太尼类μ型阿片受体激动剂,在人体内1 min左右可迅速达到血脑平衡,在组织和血液中可迅速被水解,具有起效速度快、维持时间短等优势[18]。夏莹等[19]研究表明:瑞芬太尼的镇痛、不良反应呈剂量依赖性,对于μ型阿片受体激动作用能被纳洛酮拮抗。同时,瑞芬太尼能通过抑制Akt通路及调控B细胞淋巴瘤(bcl)-2/Bcal-2相关蛋白表达,抑制肿瘤细胞的增殖,加快其凋亡速度。罗星等[20]研究表明:恶性肿瘤的发生与发展常伴有细胞增殖的失控,而Cyclin D1可通过调节、激活细胞周期依赖性酶完成细胞的增殖与分裂,参与子宫内膜癌的发生与发展。本研究中,四组不同浓度瑞芬太尼处理后miR-212-3p mRNA呈上升趋势,而LIN28B mRNA水平呈下降趋势;四组Cyclin D1、MMP-2、MMP-9及LIN28B蛋白比较差异具有统计意义,从本研究结果看出,瑞芬太尼作用于子宫内膜癌细胞中,能通过调节Cyclin D1、MMP-2及LIN28B蛋白影响细胞的增殖与分化。

miR-212-3p属于是一种miRNA,在骨肉瘤、胰腺癌、胃癌等细胞中呈低表达,与肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁移等紧密相关,可作为潜在的治疗靶点。生物学软件预测结果表明:LIN28同源物可能是miR-212-3p的基因靶点。LIN28属于高度保守的锌指家族蛋白成员,在肝癌、胃癌及宫颈癌等实体瘤中表达升高,可作为患者预后的生物学指标。而子宫内膜癌细胞的迁移与侵袭亦是恶性肿瘤重要的特征之一,发病后常伴有miRNA基因表达异常,可参与细胞的增殖、凋亡及分化过程。本研究中,随着瑞芬太尼浓度增加,迁移细胞数与侵袭细胞数呈下降趋势,呈剂量依赖性;miR-NC组细胞增殖抑制率低于miR-212-3p mimics组;迁移细胞数、侵袭细胞数多于miR-212-3p mimics组;抑制LIN28B蛋白后si-LIN28B细胞增殖抑制率高于si-NC组;迁移细胞数、侵袭细胞数及LIN28蛋白均低于si-NC组。从本研究结果看出,miR-212-3p在子宫内膜癌的发生、发展中发挥了重要的作用,能通过调控相关蛋白表达,调节细胞的增殖与迁移,miR-212-3p有望成为子宫内膜癌新的治疗靶点,通过有效的方法提高患者体内miR-212-3p水平,能延缓病情发展,降低患者病死率。

综上所述,瑞芬太尼能抑制子宫内膜癌细胞生物学活性,可能与药物调控miR-212-3p/LIN28B通路有关。