非洲猪瘟病毒pS273R 蛋白的生物信息学分析

赵金兵，王莫离，王铁军，石建州，姚伦广

（1.南阳师范学院，河南 南阳 473061；2.南阳农业职业学院，河南 南阳 473000）

赵金兵，王莫离，王铁军，等.非洲猪瘟病毒pS273R 蛋白的生物信息学分析［J］.畜牧与饲料科学，2023，44（2）：32-38.

非洲猪瘟（African swine fever，ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）感染家猪和野猪引起的一种急性、出血性、烈性传染病。该病于1921 年首次报道在肯尼亚暴发，百年来一直在世界各地流行蔓延。2018 年在我国辽宁省沈阳市首次出现ASF 疫情，之后迅速席卷全国。ASFV 属于核质巨DNA 病毒（nucleocytoplasmic large DNA viruses，NCLDVs）超家族［1］，是ASF 病毒科（Asfarviridae）ASF 病毒属（Asfivirus）唯一成员。ASFV 病毒粒子的直径260～300 nm，是线性双链DNA（double-stranded DNA，dsDNA）囊膜病毒，基因组大小为170～194 kbp［2］，含有150～167 个开放阅读框（open reading frames，ORFs）［3］，成熟病毒粒子的基因组依次包裹着内核芯壳 （core shell）、内膜（inner envelope）、衣壳（caspid）和外囊膜（inner envelope）4 层蛋白壳［4］。

ASFV 结构特征复杂、蛋白功能多样，导致ASFV 逃逸适应性免疫应答和干扰宿主天然免疫系统，易于抑制和逃避宿主的免疫，便于增殖，使这种巨型病毒难以控制。ASFV 基因组编码的蛋白参与病毒生命周期的调控以及免疫逃逸［5-6］。病毒蛋白是解析抗原结构、认识蛋白功能、寻找药物靶点、制备抗体、建立检测方法、研制疫苗的基础和前提，因此，分析ASFV 抗原蛋白是ASFV 免疫学和疫苗学研究的关键。ASFV 内核芯壳蛋白主要包括CP2475L 基因编码的多聚蛋白前体pp220 和CP530R 基因编码的多聚蛋白前体pp62，二者在蛋白酶pS273R 切割加工下，水解成多个成熟的病毒结构蛋白产物，分别为p150、p37、p34、p14、p5、p35、p15、p8［7］，均是ASFV 内核芯壳的重要组分，影响蛋白核心包装与成熟［6］。pS273R 具有重要的生物学功能，介导ASFV 的复制和宿主的炎症反应等过程，通过非典型切割Gasdermin-D （GSDMD）的途径抑制细胞焦亡［8］。pS273R 蛋白主要的结构域有核心结构域与新颖的能够维持酶活性的N-端手臂结构域；C 端结构域包含由催化三联体Cys-His-Asn 组成的核心结构域，在结构相似度上，与半胱氨酸类蛋白酶高度相似［9］。pS273R 蛋白属于半胱氨酸蛋白酶家族，具有SUMO-1 样蛋白酶保守的催化基序特征，合成于病毒感染早期，主要定位在胞质 “病毒工厂”。pS273R 蛋白是探究ASFV 内核芯壳蛋白结构组成、分布位置、作用功能的前提和基础，在研制ASFV 抑制剂等抗病毒药物方面具有潜在的应用价值。

ASF 对养猪业构成重大威胁，是全球养猪业的灾难性疾病，防控形势十分严峻。目前尚无商业化疫苗和治疗药物［10］，扑杀成为控制ASF 疫情的首选方法。2020 年我国出现了低致死率的ASF 基因Ⅱ型自然变异流行株，水平传播能力强，潜伏期长，具有一定的隐蔽性，变异株和经典株共存、共流行，使早期诊断难度增加，监测和精准清除更加困难，给ASF 的防控带来了更大的挑战［11］。探索解析ASFV 感染、致病、免疫逃逸等机制是亟须阐明的科学问题，了解与ASFV 基因组复制、侵染、免疫逃逸等环节相关的关键蛋白的结构和功能，筛选抑制剂的有效靶标，研发疫苗和药物，对ASF 的防治具有重要意义。

广泛应用于各个领域的生物信息学（bioinformatics）是一门新兴于20 世纪末的交叉学科。生物信息学主要通过生命科学和计算机科学综合处理并解析采集获得的生物学信息大数据，是一种高效的预测分析手段。随着科学技术的快速发展和各类数据库的不断完善，生物信息学在生命科学研究领域的重要性越加凸显，在促进生命科学发展方面是一种必不可少的研究工具。近年来，生物信息学在免疫学和兽医学领域也受到广泛的关注与应用。利用生物信息学的分析结果能够减少前期试验的随机性和盲目性，有助于有针对性地开展验证性试验，减少不必要的研究试验，节省时间，加速试验进程，提高试验效率。

该研究采用生物信息学方法分析不同ASFV毒株的pS273R 基因序列同源性以及遗传进化关系，预测pS273R 蛋白的理化性质、二级结构、磷酸化位点、糖基化修饰、亚细胞定位、三级结构等，以期为pS273R 蛋白结构和功能的深入解析以及ASFV 抑制剂的研制提供参考。

1 材料与方法

1.1 pS273R 基因序列同源性及遗传进化分析

从非洲猪瘟病毒数据库 （The African Swine Fever Virus Database，ASFVdb）（http：//asfvdb.popgenetics.net/）中下载43 个不同毒株的pS273R 基因序列，使用DNAMAN 6.0 和DNAStar 7.0 软件分析其核苷酸序列同源性以及遗传进化关系。

1.2 pS273R 蛋白理化性质预测

利用ExPASy-ProtParam 在线软件（http://web.expasy.org/protparam/）分析pS273R 基因编码蛋白的氨基酸组成及理化性质。

1.3 pS273R 蛋白二级结构、磷酸化位点、糖基化修饰分析及亚细胞定位

利 用SOPMA （http://npsaprabi.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl?page =npsa_sop -ma.html）对pS273R 蛋白二级结构进行在线分析。使用Net-Phos 3.1 软件（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetPhos-3.1）分析磷酸化位点。应用NetNGlyc 1.0 Server（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetNGlyc -1.0）在 线 软 件 分 析pS273R 蛋白糖基化修饰。通过在线分析软件PSORTII（https://psort.hgc.jp/cgi-bin/runpsort.pl）预测分析pS273R 蛋白亚细胞定位。

1.4 pS273R 蛋白三级结构预测

利用在线软件SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/interactive）预测分析pS273R 蛋白的三级结构。

2 结果与分析

2.1 不同毒株的pS273R 基因序列同源性及遗传进化关系分析

分离自中国的5 个ASFV 毒株（China_HLJ_20 18、China_ASFV-SY18_2018、China_AnhuiXCGQ_2018、China_wbBS01_2018、China_LN_2018）的pS2 73R 基因序列同源性为100%，与分离自其他国家的38 个不同ASFV 毒株的pS273R 基因序列同源性在93.60%～100%（见图1）。

图1 43 株ASFV 的pS273R 基因序列同源性比较

通过构建进化树发现，43 株ASFV 的pS273R基因序列总体分为2 类，即欧洲分支和非洲分支，中国的ASFV 毒株与欧洲分支的亲缘关系较近，提示中国毒株可能来源于欧洲（见图2）。

图2 43 株ASFV 的pS273R 基因序列遗传进化分析

2.2 pS273R 蛋白理化性质预测

pS273R 蛋白由4 415 个原子组成，分子式为C1410H2196N386O407S16，相对分子质量为31.58 kDa。由273 个氨基酸组成，赖氨酸（lysine）、苏氨酸（threonine）、亮氨酸（leucine）所占比例较高，分别为8.4%、7.7%、7.3%。其中，带正电荷的残基（arginine+lysine）总数为38 个，带负电荷的残基（aspartic acid+glutamate）总数为30 个。理论等电点（pI）为8.96。在哺乳动物体外网织红细胞中的半衰期是30 h，脂肪系数为72.45，不稳定系数为44.89，总平均亲水性 （grand average of hydropathicity，GRAVY）是-0.447。

疏水性和亲水性是蛋白质的重要特性，这2项指标对于预测分析蛋白质二级结构具有参考性。利用ExPASy（https://www.expasy.org/）网站中的ProScale 在线工具分析pS273R 蛋白，获得pS273R 蛋白亲疏水性序列分析图谱。以0 为界，正值和负值分别指氨基酸的疏水性与亲水性。正值越大疏水性越强；反之，负数绝对值越大，则其亲水性越强。预测值在-0.5～0.5 时，推测氨基酸可能属于两性氨基酸。ASFV 的pS273R 蛋白分析结果表明，第172 位的异亮氨酸（isoleucine）疏水性最强，分值为1.311；位于第228 位的丝氨酸（serine）是亲水性最强的氨基酸，分值为-2.411（见图3）。分析结果显示，pS273R 蛋白存在数量不少的亲水域，该结果和理化性质中总平均亲水性（GRAVY）的结果是一致的，综合分析数据表明pS273R 蛋白是一种亲水性蛋白。

图3 pS273R 蛋白的疏水性分析结果

2.3 pS273R 蛋白二级结构分析与亚细胞定位

多肽链的空间局部构成与形状是蛋白质的二级结构，蛋白质的肽链依靠氢键按照一维的方向进行排列分布，从而形成了具有周期结构特征的构象［12］。二级结构的主要类型包括4 种：α-螺旋、β-折叠、β-转角以及无规卷曲。通过ExPASy 网站的SOPMA 在线工具对pS273R 蛋白的氨基酸序列二级结构进行预测分析。结果表明，pS273R 蛋白的二级结构以α-螺旋（Hh）、延伸链（Ee）、β-转角（Tt）、无规卷曲（Cc）4 种形式为主。pS273R 蛋白的α-螺旋（Hh）有118 个氨基酸，占氨基酸总数的43.22%；延伸链（Ee）有43 个氨基酸，占氨基酸总数的15.75%；β-转角（Tt）有11 个氨基酸，占氨基酸总数的4.03%；无规卷曲（Cc）有101 个氨基酸，占氨基酸总数的37.00%，氨基酸的整条链贯穿了这4 种不同的结构（见图4）。

图4 ASFV 的pS273R 蛋白二级结构分析结果

通过NetPhos 3.1 软件分析发现 （见图5）：pS273R 蛋白存在28 个磷酸化位点，分别为12 个丝氨酸 （serine）（红色）、12 个苏氨酸（threonine）（绿色）和4 个酪氨酸（tyrosine）（蓝色），包含PKA、PKC、unsp、cdk5、GSK3、SRC、CKI、CKII、DNAPK、INSR、cdc2 总共11 类蛋白质激酶结合位点。

图5 ASFV 的pS273R 蛋白磷酸化位点分析

利用NetNGlyc 1.0 Server 在线软件分析pS273R 蛋白糖基化修饰，在第83 位和第246 位天冬酰胺残基上各存在1 个潜在的N-糖基化修饰（见图6）。

图6 ASFV 的pS273R 蛋白糖基化位点分析

应用PSORTII 软件预测pS273R 蛋白的亚细胞定位，在ASFV 感染宿主细胞后，宿主细胞内可能存在的分布位置有以下几种可能：首先存在可能性最高的是位于细胞的胞质中（P=47.8%），其次是线粒体，可能性为26.1%，定位于细胞核的概率为13.0%，此外，存在于细胞骨架、空泡、过氧化物酶中的可能性均为4.3%。

2.4 pS273R 蛋白的三级结构分析

利用SWISS-MODEL 对pS273R 蛋白的三级结构进行预测分析，结果显示，pS273R 蛋白的三级结构是由二级结构α-螺旋、β-转角、β-折叠以及无规卷曲等经过旋转、折叠与卷曲等生物过程而形成（见图7），与6lj9.1.A（crystal structure of Se-Met ASFV pS273R protease）的同源性为97.07%。

图7 ASFV 的pS273R 蛋白的三级结构预测

3 讨论

利用生物信息学工具分析目的蛋白质，预测蛋白质的同源性系统进化、理化特性、物理结构等重要信息，对探析蛋白质的结构与功能、功能与机制具有参考价值，能够为将要开展的研究工作提供新的思路和线索［13-14］。该研究分析表明，pS273R基因相对保守，国内流行的5 个ASFV 毒株的pS273R 基因序列相同，与国外其他38 个毒株的同源性在93.60%～100%；预测pS273R 蛋白有2个潜在的N-糖基化修饰位点，糖基化对真核生物蛋白质的抗原表位和热稳定性具有一定程度的影响［15］。病毒蛋白质的二级结构与抗原决定簇的关系密切，线性B 细胞表位含有的亲水性氨基酸数量越多，肽段区域的柔韧性能越高，更有利于抗原与抗体嵌合［16］。作为蛋白质中心的“支架”β-折叠的化学键，其键能越高，越不利于实现嵌合抗体；而表面的无规则卷曲结构易于识别并结合抗体，该位置成为抗原表位的潜力更大［17］。pS273R 蛋白是ASFV 复制、核成熟以及感染宿主不可缺少的酶，抑制pS273R 的酶活性，可影响水解多聚蛋白前体的加工过程，导致病毒滴度下降，抑制病毒增殖；而抑制多聚蛋白前体的表达，组装形成的20面体空衣壳丧失感染性［18-19］。新的研究证实了pS273R 蛋白可切割GSDMD，从而阻碍了细胞焦亡的启动，便于病毒的复制，明确了pS273R 蛋白在炎症反应和病毒复制中的关键作用，揭示了一种新的ASFV 抑制细胞焦亡的作用机制［8］。pS273R 蛋白存在大量的α-螺旋和无规则卷曲结构，是具有较多潜在B 细胞抗原表位的亲水性蛋白，可为抗ASFV 药物的研发提供候选分子靶标。

4 结论

对ASFV 的pS273R 基因和pS273R 蛋白进行了生物信息学分析，揭示了不同国家ASFV 流行毒株pS273R 基因的同源性及进化关系，预测了pS273R 蛋白的理化性质、二级结构、磷酸化位点、糖基化修饰、亚细胞定位、三级结构等关键信息，研究结果可为进一步探究ASFV 的感染机制以及研制抗ASFV 药物提供参考。