常温和低温纤维素降解菌的筛选及其酶活特性

岳林芳，成立新，李蕴华，苏少锋，于朝晖，王志铭，吴海青

（内蒙古自治区农牧业科学院，内蒙古 呼和浩特 010031）

岳林芳，成立新，李蕴华，等.常温和低温纤维素降解菌的筛选及其酶活特性［J］.畜牧与饲料科学，2023，44（2）：9-16.

农业废弃物主要包括农作物秸秆和畜禽粪便等，好氧堆肥是其无害化处理和资源化利用的重要方式［1-3］。好氧堆肥能够把畜禽粪便转化为富含有机氮、有机碳及其他养分的有机肥，满足植物对氮肥和磷肥的一定需求并减少化肥的使用［4］。接种特定微生物会强化堆肥过程，对堆肥中的微生物群落产生影响，加快堆料降解并提高堆肥产品中的腐殖质含量［5］。纤维素类物质是农作物秸秆和畜禽粪便的主要组成成分，是一种葡萄糖聚合物，由D-葡萄糖通过1，4-β-D-葡萄糖苷键连接而成，其降解主要依靠纤维素降解菌［6-7］。目前已经发现很多种类的可培养纤维素降解菌，如细菌、放线菌和真菌都具有降解纤维素能力［8］，这些菌通过分泌漆酶、木质素过氧化物酶、纤维素酶和半纤维素酶等酶来降解纤维素类物质［9］。细菌来源广，分泌的酶种类多，繁殖速度快，可以在各种极端环境中生存，因此，易于大规模生产［10］。

许多学者对各种生境中的纤维素降解菌资源进行了挖掘研究，Behera 等［11］从红树林土壤中筛选到了14 株纤维素降解菌，分别为微球菌属（Micrococcus）、芽孢杆菌属（Bacillus）和假单胞菌属（Pseudomonas）等。王海滨等［12］从采集的腐殖土和堆肥中，分离纯化得到了216 株常温纤维素降解菌，包括细菌、真菌和放线菌；李静等［13］从杜鹃林下土壤中分离获得了15 株纤维素降解菌；郑丽等［14］从木薯生境中筛选到了57 株产纤维素酶的细菌菌株；吴庆珊［15］从不同生境及市售菌剂样品中分离筛选出纤维素降解细菌156 株、真菌68 株和放线菌43 株；张必周等［16］在15 ℃培养条件下，分离得到了11 株具有降解纤维素能力的菌株；孟建宇等［17］从土壤样品中分离到59 株纤维素降解细菌：在10 ℃下分离到36 株低温纤维素降解细菌，在28 ℃下分离到23 株常温纤维素降解细菌；董雪丽等［18］从腐化水稻秸秆中，在10 ℃下筛选出具有一定纤维素分解能力的菌株6 株，其中包括2 株真菌和4 株细菌。但是，适合我国内蒙古等北方地区的常温和低温纤维素降解功能菌研究较少［19］。

对内蒙古地区常温和低温菌株进行研究，可以获得适合的高效降解纤维素菌株，为促进牛羊粪污和秸秆堆肥处理提供新型功能菌株，为研发微生物复合菌剂、纤维素酶制剂和微生物肥料提供依据，进而促进环境污染和资源浪费等问题的有效解决。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品来源

样品是采集自内蒙古乌拉特中旗某林场0～10 cm 的落叶林腐殖土、锡林郭勒盟德美纯种肉羊种羊场的新鲜羊粪和稻草、呼和浩特市和林格尔县某养殖场的驴粪，将样品置入灭菌袋中，再放入低温冰袋后运回实验室，于4 ℃冰箱保存。

1.1.2 主要培养基

赫奇逊 （Hutchison）培养液：NaNO32.5 g，KH2PO41.0 g，NaCl 0.1 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，FeCl30.01 g，CaCl20.1 g，pH 值为7.2～7.3，蒸馏水1 000 mL。羧甲基纤维素钠（CMC-Na）培养基：CMC-Na 5.0 g，酵母粉2.0 g，KH2PO42.0 g，MgSO40.5 g，琼脂15 g，蒸馏水1 000 mL。

1.2 试验方法

1.2.1 纤维素降解菌株初步分离、筛选

使用羧甲基纤维素钠培养基对采集的样品进行纤维素降解菌株的初步分离、筛选。首先在三角瓶中放入20 g 样品，按1∶10 的比例将样品稀释，加入200 mL 已灭菌的蒸馏水，制备成菌悬液；于室温下，以120 r/min 的速度振荡40 min，使样品被充分打散，促使菌完全游离出来，并均匀分布在水中。然后取100 μL 适当稀释梯度的菌悬液，涂布于羧甲基纤维素钠培养基平板上，进行培养和分离，在30 ℃（常温）条件下培养3～5 d 和在18 ℃（低温）条件下培养7～10 d。在培养期间，观察菌落的生长情况，挑取不同颜色、大小或形状的菌落进行分离纯化，获得单菌落纯培养物。最后在羧甲基纤维素钠培养基平板上，反复将单菌落划线纯化，直至得到纯菌株。

1.2.2 形态学鉴定

对分离获得的细菌菌株，使用革兰染色法进行形态学观察和纯度判定。

1.2.3 菌株的保存

已分离得到的纯菌株使用75%的甘油进行保存，且放于-80 ℃冰箱。

1.2.4 分子生物学鉴定

对已分离得到的细菌和真菌菌株，分别使用16S rDNA 和ITS 基因序列分析技术进行分子生物学鉴定。鉴定方法：首先用引物27F/1492R 或ITS1/ITS4 进行PCR 扩增，然后将PCR 产物切胶纯化回收，再用引物27F/1492R 或ITS1/ITS4 测序，最后将测序结果序列在NCBI BLAST 数据库进行比对，进而完成菌种鉴定。

1.2.5 利用刚果红染色法进一步筛选

在生长单菌落的羧甲基纤维素钠培养基上，加入适量1 mg/mL 刚果红染液，染色15～20 min，将染液弃掉，加入适量的浓度为1 mol/L 的NaCl溶液，进行洗涤脱色30～60 min。观察菌落周围的水解圈情况。纤维素降解菌株的判断依据是有水解圈，并通过培养基透明圈Dc 值的大小［Dc=水解圈直径（D，cm）/菌落直径（d，cm）］，初步判断菌株的纤维素降解能力，进而筛选得到纤维素降解效果较好的菌株。

1.2.6 利用滤纸条降解法进行更进一步筛选

将分离得到的菌株培养于Hutchison 培养液中，进行滤纸条降解试验：取3 mL 菌悬液接种于盛有45 mL 滤纸条崩解培养基 （Hutchison 培养液）的离心管中，放入规格为1 cm×6 cm 的新华Ⅰ号滤纸条，30 ℃振荡培养10 d 和18 ℃振荡培养15 d，期间轻微摇匀，定期观察滤纸条崩解情况。对照组为不接种菌液但放有滤纸条的崩解培养基，设计3 个重复。观察各管中滤纸条降解溃烂情况，进一步筛选出降解纤维素效果更好的菌株，判断依据为滤纸条崩解程度：滤纸边缘已膨胀用“+”表示；滤纸整体膨胀并已下弯用“++”表示；滤纸呈不定状用“+++”表示；滤纸呈糊状用“++++”表示；滤纸呈半清状用“+++++”表示。

1.2.7 分离菌株酶活力测定

以2 mL 1%（W/V）的CMC-Na 缓冲液为反应底物测定羧甲基纤维素酶 （carboxymethyl cellulose，CMCase）活性；以浸泡有0.2 g（无淀粉）滤纸条的2 mL 柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液为反应底物测定滤纸酶活性 （filter paper activity，FPA）；以2 mL 1%（W/V）的微晶纤维素（microcrystalline cellulose，MCC）缓冲液为反应底物测定外切酶（C1）活性；以2 mL 1%（W/V）水杨苷缓冲液为反应底物测定β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，β-Gase）活性，再接入1 mL 发酵粗酶液于25 mL 的比色管中，放入恒温（50 ℃）水浴或恒温箱中反应30 min 后，加3 mL 3，5-二硝基水杨酸 （3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）溶液使反应终止。将装有混合液的比色管在沸水浴煮8～10 min 后，用凉水立即冷却，加入蒸馏水定容至25 mL，在540 nm 下用酶标仪测定吸光值。酶活定义：在50 ℃反应条件下，1 min 内催化底物生成1 μmol 葡萄糖所需要的纤维素酶的量，用1 U/mL 表示［17］。分离菌株酶活力的测定，通过公式计算酶活：U=K（m1-m0）/30，式中，U 为样品的酶活，1 个酶活单位代表1 mL 原样酶液1 min产生1 μg 葡萄糖的酶的量；m1为样品葡萄糖量，m0为对照葡萄糖量（与标准葡萄糖曲线对照，计算出样品和对照的葡萄糖量）；K 为样品稀释倍数；30 为酶与底物反应时间。分离筛选得到的菌株测定其CMCase 酶活，选择CMCase 酶活高的菌株测定其FPA、C1和β-Gase 酶活。

2 结果与分析

2.1 分离保存菌株的16S rDNA 和ITS 鉴定结果

在30 ℃培养条件下，利用羧甲基纤维素钠培养基对采集样品进行初步分离、筛选，再经菌株分子生物学鉴定，从稻草、腐殖土、羊粪和驴粪样品中共分离、纯化、完成鉴定和保存菌株27 株，包括芽孢杆菌属 （Bacillus）12 株、假单胞菌属（Pseudomonas）5 株、肠杆菌属（Enterobacter）3 株、链霉菌属（Streptomyces）3 株、志贺氏菌属（Shigella）1株、曲霉菌属 （Aspergillus）1 株、微球菌属（Microbacterium）1 株和鲍特氏菌属（Bordetella）1 株。具体结果见表1。

表1 常温条件下分离菌株的16S rDNA 和ITS 鉴定结果 单位：%

在18 ℃的培养条件下，利用羧甲基纤维素钠培养基对采集样品进行初步分离、筛选，经菌株的分子生物学鉴定，结果表明，从稻草、腐殖土、羊粪和驴粪样品中共分离、完成鉴定和保藏菌株17株，包括假单胞菌属（Pseudomonas）7 株、芽孢杆菌属（Bacillus）3 株、不动杆菌属（Acinetobacter）3 株、肠杆菌属 （Enterobacter）1 株、干燥杆菌属（Siccibacter）1 株、寡养单胞菌属（Stenotrophomonas）1株和鞘脂杆菌属（Sphingobacterium）1 株。孟建宇等［20］报道得出，筛选获得的低温纤维素降解菌株主要属于假单胞菌属、芽孢杆菌属和不动杆菌属等，该结果与其报道相似。具体鉴定结果见表2。

表2 低温条件下分离菌株的16S rDNA 鉴定结果 单位：%

2.2 纤维素刚果红水解圈试验和滤纸条降解试验结果

在30 ℃的培养条件下，通过纤维素刚果红水解圈试验和滤纸条降解试验对已分离保存的菌株进行研究，结果表明，筛选到有较强刚果红水解圈的菌株7 株，分别为C-5、C-黑泥、T-6-1、T-8-1、T-8-2、LF-3 和LF-6；可以更好降解滤纸条的菌株有7 株，分别为C-1、C-3、C-4、T-6-1、T-6-2、T-8-2 和LF-5。具体结果见表3。

表3 常温菌株的刚果红水解情况和滤纸降解效果

在18 ℃的培养条件下，通过纤维素刚果红水解圈试验和滤纸条降解试验对已分离保存的菌株进行研究，结果表明，筛选到有较强刚果红水解圈的菌株4 株，分别为C-5、YF-1、YF-2-1 和YF-3；可以更好降解滤纸条的菌株有3 株，分别为C-5、YF-1 和YF-3。具体结果见表4。

表4 低温菌株的刚果红水解情况和滤纸降解效果

2.3 酶活性测定结果

2.3.1 菌株纤维素酶活性测定结果

采用DNS 法对分离到的24 株常温纤维素降解菌株（不包括滤纸条降解效果最差的LF-2、LF-3 和T-8-1）和11 株低温纤维素降解菌株（不包括滤纸条降解效果最差的C-3、T-4、T-5-1、T-5-2、LF-1-1 和LF-2）的纤维素酶活分别进行了测定，35 株菌株均在常温（30 ℃）条件培养后，测定其CMCase 活性。研究得出，纤维素降解菌株T-8-2、LF-7 和LF-5 在所有菌株中的CMCase 活性最高，分 别 为 （169.24 ±2.18）、（136.79 ±2.05）、（116.01±0.52）U/mL。具体结果见表5 和表6。

表5 在30 ℃培养后常温菌株CMCase 活性测定结果单位：U/mL

表6 在30 ℃培养后低温菌株测定CMCase 活性结果单位：U/mL

2.3.2 菌株其他酶活性测定结果

在常温条件下培养后，鉴于菌株T-8-2、LF-7和LF-5 的CMCase 活性最高，接着又测定了这3株菌的FPA、C1和β-Gase 活性：菌株T-8-2 的FPA 活 性 为 （159.07±1.57）U/mL、C1活 性 为（154.23±1.06）U/mL、β-Gase 活 性 为 （165.16±1.00）U/mL；菌株LF-7 的FPA 活性为 （116.27±4.66）U/mL、C1活性为（134.36±13.39）U/mL 和β-Gase 活性为 （123.44±0.91）U/mL；菌株LF-5 的FPA 活性为（96.77±0.52）U/mL、C1活性为（97.52±1.18）U/mL 和β-Gase 活性为（98.04±0.44）U/mL，具体结果见表7。由此可见，T-8-2、LF-7 和LF-5是极具开发潜力的纤维素降解菌株。

表7 菌株T-8-2、LF-7 和LF-5 的各类酶活测定结果单位：U/mL

3 讨论

孟建宇等［17］对常温纤维素降解菌进行了研究，分离的常温纤维素降解菌在28 ℃下的相对CMCase 酶活在4～88 U/mL，其中菌株CB04 的CMCase 酶活最高，为87.2 U/mL；对CB04 进行产酶条件优化，优化后（酵母膏为氮源，培养时间为4 d，pH 值为7）的CMCase 酶活最高可达114.6 U/mL。该研究未进行产酶条件优化，常温（30 ℃）条件下培养后，得到CMCase 酶活最高的纤维素降解菌株为T-8-2、LF-7 和LF-5，其CMCase 酶活分别为（169.24±2.18）、（136.79±2.05）、（116.01±0.52）U/mL，均高于孟建宇等［17］的研究结果。许玉林等［21］在28 ℃条件下筛选到纤维素酶高产菌株草酸青霉SJ1，滤纸酶活和CMCase 酶活分别为25.15 U/mL 和740.42 U/mL，草酸青霉SJ1 的CMCase 酶活远远高于该研究得到的3 株纤维素降解菌株T-8-2、LF-7 和LF-5 的CMCase 酶活，但是草酸青霉SJ1 的FPA 活性明显低于T-8-2、LF-7和LF-5 的酶活。

孟建宇等［17］对低温纤维素降解菌也进行了研究，低温纤维素降解菌在10 ℃下的相对酶活性不高，在2～12 U/mL，其中菌株FB4 的酶活最高，为11.6 U/mL。尚晓瑛等［22］从黑龙江林场腐殖土中筛选的耐低温纤维素分解菌B6-15，属于假单胞菌属，20 ℃培养3 d 酶活性为24.94 U/mL。李娜等［23］在18 ℃条件下，从小兴安岭山区土壤中分离到1株在低温下具有较强纤维素降解能力的真菌菌株C1，滤纸酶活和CMCase 酶活分别为18.4 U/mL 和54.3 U/mL。低温纤维素降解菌株在生物降解过程中常出现酶活性低的问题［24］，而酶活性不仅与微生物自身的遗传特性有关，还会受到菌株发酵条件（如培养基成分、接种量和培养时间等）的影响［25］。

4 结论

寻找适合的纤维素降解菌株是解决内蒙古地区牛羊粪污高效堆肥处理的关键方法。该研究总共分离获得44 株纤维素降解菌株，分别包括在30 ℃下分离得到的27 株常温纤维素降解菌株和18 ℃下分离得到的17 株低温纤维素降解菌株。该研究揭示了内蒙古部分地区可培养纤维素降解菌的类群组成及其纤维素降解能力，可为了解和利用纤维素降解菌株提供依据和实践基础。常温纤维素降解菌株T-8-2、LF-7 和LF-5 的CMCase 酶活最高，是极具开发潜力的纤维素酶生产菌株，可以作为内蒙古等北方地区有效降解纤维素的潜力菌株应用于粪污堆肥发酵剂的研制中。