梅花不同花色品种及开花阶段类黄酮代谢物测定与分析

吴思惠，朱欢欢，张俊卫，包满珠，张杰

梅花不同花色品种及开花阶段类黄酮代谢物测定与分析

华中农业大学园艺林学学院/果蔬园艺作物种质创新与利用全国重点实验室，武汉 430070

【目的】花色是梅花（）极其重要的观赏性状，类黄酮是梅花花瓣中的主要色素，但目前关于梅花类黄酮化合物的组成及其与花色关系的研究较少。研究梅花类黄酮化合物可为梅花花色形成机理以及梅花类黄酮资源开发提供参考。【方法】本研究选取4个代表花色的梅花品种盛花期及两个品种花色变化关键时期花瓣作为试验材料，首先采用RHSCC比色卡比色法和色差仪测定不同品种各时期花瓣的花色表型，用高效液相色谱质谱联用技术（highperformanceliquidchromatography-massspectrometry，HPLC-MS）对各品种不同开花时期的类黄酮组成进行定性、定量研究，进一步通过Duncan检验和正交偏最小二乘判别分析不同花色品种间差异代谢物以及开花过程中与花色变化相关的类黄酮代谢物。【结果】在梅花花瓣中共鉴定出25种黄酮类化合物。其中，红色‘白须朱砂’和紫红色‘虎丘晚粉’的主要成分为花青素类化合物，‘白须朱砂’和‘虎丘晚粉’间矢车菊素及其衍生物含量存在差异。从大蕾期到盛花期，‘白须朱砂’红色逐渐变浅，矢车菊素-3--葡萄糖苷和芍药花素-3--葡萄糖苷的含量也逐渐下降。黄绿色‘变绿萼’和纯白色‘三轮玉蝶’所含主要类黄酮化合物为槲皮素及其衍生物，‘变绿萼’和‘三轮玉蝶’间槲皮素衍生物含量存在差异。【结论】不同花色品种梅花的类黄酮化合物含量不同，有医药价值的类黄酮化合物在各品种中均有分布。其中，矢车菊苷和芍药花苷含量差异可能与红色梅花花色差异有关，而槲皮素衍生物可能影响黄绿色梅花花色形成。本研究首次对不同花色梅花品种类黄酮代谢物进行了鉴定及差异分析，从代谢层面初步认识了不同花色梅花品种以及梅花开花过程中的差异及变化，研究结果对进一步理解梅花花色差异原因及梅花类黄酮资源开发提供了参考。

梅花；花色；类黄酮化合物；高效液相色谱质谱联用

0 引言

【研究意义】梅花（Sieb. et Zucc.）是蔷薇科（Rosaceae）李属（）的观赏性植物，原产我国南方，距今已有3000多年的栽培历史[1]。花色作为梅花的重要观赏性状，具有十分重要的观赏价值和商业价值[2]。梅花花色主要有白、黄、绿、粉红、深红等颜色，且伴随着梅花品种进化而逐渐丰富[3]。类黄酮是梅花花瓣中的主要色素，研究梅花类黄酮化合物可为梅花花色形成机理研究以及梅花类黄酮资源开发提供参考。【前人研究进展】在2004年以前，梅花研究多集中于梅花耐寒性引种驯化，而梅花花色相关研究几乎空白[4]。之后，赵昶灵等[4]首次报道了典型花色梅花花瓣中的色素种类及含量，其中红色梅花的红色色素为矢车菊素、芍药色素类，而白色梅花的色素则为黄色或者无色的黄酮类及其苷。梅花花色根据花青素有无分为红、白两大类。另外，梅花‘粉皮宫粉’的粉红色花色色素为花青素-3-糖苷（3-glycoside），梅花‘南京红’花瓣中的3种主要花色苷为cyanidin 3--(6″--α- rhamnopyranosyl--glucopyranoside)、cyanidin 3-- (6″--galloyl--glucopyranoside)和cyanidin 3--(6″---feruloyl--glucopyranoside）[5]。张芹[6]对41个梅花品种花瓣中的花青素苷进行了定性定量分析，但并没有对其他的类黄酮化合物进行研究。郑毓珍等[7]为探究梅花的抗氧化活性用HPLC法同时测定了白梅花（绿萼梅）中芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素、山柰酚、异鼠李素等成分。但在其他梅花品种中，这些类黄酮化合物目前还没有深入研究。类黄酮是苯丙素类中的一类次级代谢物，涉及颜色范围最广，从淡黄色到蓝色[8]。类黄酮代谢物包括查尔酮、二氢黄酮、黄酮、类黄酮和花青素等[9]。其中，花青素苷是使花朵呈色的重要色素之一，通过诱导植物组织中的红色到蓝色色素沉淀，帮助植物吸引传粉者和种子传播者，同时在提高植物抗逆性方面发挥着重要作用[10]。黄酮醇是一种淡黄色或无色的化合物，它不仅是花青素的共色素，还能吸收紫外线保护花瓣和吸引授粉昆虫[8]。此外，类黄酮化合物还有潜在的药用价值，调查表明，摄入类黄酮可以降低各种非传染性疾病的发病率，部分类黄酮在体内外也表现出较强的抗氧化特性，以及抗糖尿病、抗肥胖、抗炎性、抗癌和抗菌活性[11-12]。现代药理学研究揭示了梅的多种生物活性和生物活性机制，包括抗糖尿病[13-14]、抗肿瘤[15]、抗炎[16]和抗生素[17]活性。有研究表明，绿萼梅类黄酮成分具有清除自由基、抑制醛糖还原酶和抗血小板凝集的作用[18]，并且总黄酮能改善大鼠抑郁行为[19-20]。梅花提取物的药用价值是近年来的研究热门，但其有效成分及作用机制有待进一步研究证实[21-23]。【本研究切入点】目前，梅花花色的研究主要集中在花青素，而作为重要的辅助呈色色素，黄酮和黄酮醇化合物在梅花中还没有被系统鉴定，梅花类黄酮化合物资源还有待开发。另外，花青素与黄酮/黄酮醇化合物在梅花呈色过程中如何相互作用也尚未见研究。【拟解决的关键问题】本研究选择花色不同的4个梅花品种，包括‘白须朱砂’‘虎丘晚粉’‘变绿萼’‘三轮玉蝶’。利用高效液相色谱质谱联用技术对梅花花瓣中类黄酮化合物的成分及含量进行检测，对梅花花瓣类黄酮化合物资源进行探索；另外，以纯白色的‘三轮玉蝶’为对照，讨论类黄酮成分与不同花色表型的关系。通过表型观测确定‘白须朱砂’和‘变绿萼’开花过程中花色变化的主要阶段，比较不同开花阶段的花色表型差异以及类黄酮物质组成差异，并进一步分析主要影响梅花花色变化的类黄酮成分。

1 材料与方法

试验于2020年在华中农业大学园艺林学学院进行。

1.1 植物材料

试验所用梅花品种（图1）来自中国梅花研究中心（武汉），包括宫粉品种群的‘虎丘晚粉’（粉红色，HQWF），绿萼品种群的‘变绿萼’（黄绿色，BLE），朱砂品种群的‘白须朱砂’（深红色，BXZS），玉蝶品种群‘三轮玉蝶’（白色，SLYD）。

于梅花花期的晴天早晨、露水刚干之际（上午约10：00开始），从花发育良好的中段枝条上采集‘白须朱砂’和‘变绿萼’3个花色发育阶段的梅花花瓣，立刻置液氮迅速冷冻并于-80℃保存。其中，大蕾期（S1）特征为花蕾松动但花瓣未展开；初花期（S2）特征为部分花瓣稍微展开；盛花期（S3）特征为花瓣完全展开且充盈丰满[6]。‘虎丘晚粉’和‘三轮玉蝶’仅采集S3梅花花瓣。同时采集各品种对应时期鲜花用于花色表型分析，且各品种每个阶段设置3个重复。

1.2 试剂与仪器

色谱级甲醇、甲酸和乙腈等化学药品购自Fisher Scientific（Fair Lawn，NJ）公司。内标利多卡因购自梯希爱（上海）化成工业发展有限公司。试验用超纯水由Milli-Q AdvantageA10（美国Millipore公司）超纯水系统制备，本试验所用其他试剂均为色谱纯。

A：梅花4个品种盛花期的花色表型。B、C：‘变绿萼’和‘白须朱砂’3个花色时期的花瓣颜色表型。S1：大蕾期；S2：初花期；S3：盛花期。BXZS：白须朱砂；HQWF：虎丘晚粉；SLYD：三轮玉蝶；BLE：变绿萼。下同

KQ5200DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），超纯水系统Milli-Q AdvantageA10（美国Millipore公司），离心机HSC-2015L（宁波新芝生物科技股份有限公司），Q-TOF液相色谱-质谱联用仪（美国Agilent公司），Eclipse Plus C18色谱柱（Thermo Hypersil Gold C18，100 mm×2.1 mm，1.9 μm，美国ThermoFisher公司），冷冻干燥机（上海比朗仪器制造有限公司），SCIENTZ-48高通量组织研磨器（宁波新芝生物科技股份有限公司）。

1.3 花色表型测定

首先，在光线良好的室内、避免阳光直射，分别取4个品种梅花各个时期具典型颜色特征的新鲜花朵2—3个，重瓣花按不同层拆分平置于白纸上，将梅花重瓣的中间层花瓣中上部分与英国皇家园艺学会比色卡（Royal Horticultural Society Color Chart，RHSCC）进行对比。重复10次，以出现频率最高的结果作为该品种的花色。

同时，采用CM-5分光测色计（KonicaMinolta，日本）对以上梅花花瓣材料测色，具体如下：取梅花重瓣的中间花瓣，并将花瓣的中间部分对准色差仪的集光孔，在D65光源10°对所选花瓣进行中点测量明度L*值、色相a*值与b*值。最后取平均值。L值衡量的是花色的明暗程度指标，从100到0的变化过程体现了明度从白到黑的变化过程。红度a值从a到a转变中体现了绿色减退，红色增强。黄度b值从b到b变化过程中代表了蓝色减退，黄色增加。

1.4 样品制备

配制含2%甲酸的甲醇浸提剂，向浸提剂加入内标利多卡因0.2 mg∙L-1。电子天平称0.015—0.025 g样品后磨样。加浸提剂（0.1 g样加800 μL提取液），振荡混匀。超声清洗（KQ5200D型数控超声波清洗器，功率100%，30 min，期间加入冰块降温，使温度不超过25℃）。将样品放至4℃环境，静置24 h。离心（13 000 r/min，10 min）。上清液用0.22 μm微孔滤膜过滤，装于2 mL安捷伦上样小瓶中[24]。

1.5 高效液相色谱质谱联用条件

液相色谱质谱联用仪型号为快速高效色谱系统（1200 series Rapid Resolution HPLC system）连接QTOF 6520质谱仪（Agilent Technologies）。采用Eclipse Plus C18色谱柱（Thermo Hypersil Gold C18色谱柱，100 mm×2.1 mm，1.9 μm）分离样品中的代谢物。流动相A为含0.1%（v/v）甲酸的超纯水，流动相B为含0.1%甲酸的纯乙腈（色谱级，Thermofisher）。梯度洗脱程序如下：0 min，5% B；20 min，95% B；22.1 min，5% B；28 min，5% B。柱温为35℃，保持恒定。流速0.3 mL∙min-1。质谱分析条件如下：离子模式为全扫描电喷雾电离（either an electrospray ionization，ESI），采用正离子模式（ESI+）进行；干燥气体（drying gas nitrogen）为10 L∙min-1；气体温度（gas temperature）为350℃；雾化气压力（nebulizer pressure）为40 psi；毛细管电压（capillary voltage）为3.5 kV。破裂电压（fragmentor）为135 V；撇渣器（skimmer）为65 V；紫外DVD选用520、350和320 nm。采用MS/MS模式分析代谢物质的结构，碰撞能量（the collision energy）为10、20和30 ev[24]。

1.6 代谢物定性和定量分析

根据高效液相色谱质谱得到代谢物的m/z值和离子碎片模式与常用质谱数据库或已发表文献中的代谢物进行比对鉴定代谢物。质谱库有Mass Bank（http://www.massbank.jp/）和HMDB（https://hmdb.ca/ metabolites/）[25]。以化合物矢车菊素3--葡萄糖苷（Cyanidin 3--glucoside）为例，具体说明通过质谱信息与质谱数据库对比鉴定代谢物过程。在‘白须朱砂’样品正离子模式扫描下的QTOF-MS/MS数据中提取一级碎片质谱图如图2-B显示，主要碎片离子质荷比（m/z）为163.0392与287.0554。该物质可能是具有一个糖基（163.0392）修饰、母核为矢车菊素（287.0554）的类黄酮，因此推断该物质为矢车菊素--葡萄糖苷。另外由前人研究证明[26]，梅花花瓣中含大量的矢车菊素3-葡萄糖苷。同时，对比在HMDB数据库中矢车菊素3-葡萄糖苷在Positive下的二级碎片质谱图（图2-C），发现本试验所得物质结构及碎片荷质比与网站的二级碎片荷质比高度吻合，因此鉴别该物质为矢车菊素3--葡萄糖苷。

利用内标法计算代谢物的相对含量。浸提剂中加入0.2 mg∙L-1的利多卡因作为内标物混入样品中，然后对含有内标物的样品进行色谱分析，提取并测定利多卡因的峰面积和各个代谢物的峰面积，利用利多卡因和各个代谢物的峰面积比计算各代谢物的相对含量。

1.7 多元统计分析

使用IBM SPSS统计软件（版本22.0，芝加哥，IL，美国）对数据进行分析。所有试验均为3个重复。采用方差分析（One-Way ANOVA）结合Duncan多元方差分析（＜0.05）进行差异显著性分析，对4个梅花品种同一时期，以及‘白须朱砂’和‘变绿萼’3个开花时期颜色参数和花瓣色素含量进行比较。在R 4.0.4中采用皮尔逊相关性分析方法分析颜色参数与色素含量的关系。

A：梅花花瓣中矢车菊素3-O-葡萄糖苷总离子流色谱图。B：梅花花瓣中矢车菊素3-O-葡萄糖苷一级质谱图。C—E：梅花花瓣中矢车菊素3-O-葡萄糖苷在碰撞能量分别为10、20和30 ev时的二级质谱图

代谢物数据采用log10变换进行统计分析，改善正态性，并进行归一化处理。利用Simca 14.1软件对样品的代谢物进行正交偏最小二乘判别分析（OPLS- DA），研究代谢物的积累特点。值设为0.05并结合VIP≥1筛选差异代谢物。

2 结果

2.1 梅花花色表型观测

根据与英国皇家园艺学会比色卡比对结果，4个梅花品种S3时期花色可分为4个色系，‘白须朱砂’为红色系，‘虎丘晚粉’为紫红色系，‘三轮玉蝶’为白色系，‘变绿萼’为黄色系（表1、图1-A）。为了更加准确地评价梅花颜色，本研究利用色差仪测定了4个梅花品种S3时期花瓣的颜色参数L*、a*、b*值。如表1所示，‘白须朱砂’和‘虎丘晚粉’的a*值较高且均为正，b*值较低且基本为负。‘变绿萼’和‘三轮玉蝶’的b*值较高且均为正，a*值较低且均为负。

通过长期观察，本研究发现开花过程中梅花花色逐渐变浅且在大蕾期、初花期、盛花期花色变化较为明显，同时考虑梅花红色花色育种与黄绿色育种目标，因此选择深红色‘白须朱砂’与浅黄绿色的‘变绿萼’进行开花时期花色变化的研究。同样地，根据与英国皇家园艺学会比色卡比对结果，S1—S3时期，‘白须朱砂’花色分别为红色系的53A、53C和54A（表1）。‘变绿萼’开花过程中，S1到S2时期花色从黄色系的4B变浅4D，S2到S3时期均为黄色系4D（表1）。利用色差仪对‘白须朱砂’和‘变绿萼’S1—S3时期花瓣的颜色参数进行测定后发现，S1—S3时期，‘白须朱砂’a*值均为正且逐渐变小，‘变绿萼’b*值均为正且逐渐变小（表1）。

表1 4个梅花品种的花色数据

不同小写字母表示多重比较Duncan检验在=0.05显著性水平下的差异显著。S1：大蕾期；S2：初花期；S3：盛花期。下同

Different lowercase letters represent the different significant differences at=0.05 level in Duncan’s test. S1: Flower budding stage; S2: Early flowering stage; S3: Blooming stage. The same as below

2.2 梅花花瓣中类黄酮代谢物定性定量分析

色素分子的种类和含量是决定植物颜色的主要因素。黄酮类化合物属于酚类化合物，是在梅花中发现的主要色素分子。本研究基于LC-MS/MS对梅花花瓣中的黄酮类化合物进行了广泛的非靶向代谢物分析，利用离子峰精确的分子质量和碎片离子信息与质谱数据库比对，在梅花花瓣中共鉴定出25种黄酮类化合物（表2），其中花青素类包括矢车菊素及其衍生物3种，芍药花素及其衍生物1种，黄酮醇类有槲皮素及其衍生物10种，山奈酚及其衍生物5种，此外还有芹菜苷、查尔酮、黄烷酮、苯丙素和反式肉桂酸（表2）。

为探究不同花色梅花中色素含量分布特点，本研究采用内标法计算梅花花瓣中黄酮类物质的含量。由表3可以发现，‘白须朱砂’和‘虎丘晚粉’花瓣中主要的类黄酮成分是矢车菊素及其衍生物，‘变绿萼’和‘三轮玉蝶’花瓣中主要的类黄酮成分是槲皮素及其衍生物。另外，矢车菊素及其衍生物总量在‘白须朱砂’中所占比例显著高于‘虎丘晚粉’，而芍药花素及其衍生物总量在‘白须朱砂’中所占比例低于‘虎丘晚粉’（表3）。S3时期，‘变绿萼’中槲皮素及其衍生物所占比例高于‘三轮玉蝶’（表3）。

S1—S3时期，‘白须朱砂’花瓣中类黄酮化合物含量整体下降（表3）。‘白须朱砂’花瓣中矢车菊素及其衍生物总量、芍药花素及其衍生物总量、飞燕草素及其衍生物总量在S1—S3时期逐渐降低，但S2—S3时期降低不显著。在‘变绿萼’的S1—S3时期，花瓣中类黄酮化合物含量整体从S1—S2时期增加，S2—S3时期略有下降，但3个时期含量变化差异不显著。同样地，‘变绿萼’花瓣中槲皮素及其衍生物总量从S1—S2时期增加，S2—S3时期略有下降，但3个时期含量变化差异不显著（表3）。

2.3 梅花4个花色代表品种及花色发育过程中差异代谢物分析

为进一步分析梅花花色差异与类黄酮代谢物的关系，本研究首先通过Duncan检验（＜0.05）和预测差异代谢物中重要的变量VIP值（VIP值≥1）对25种类黄酮进行差异代谢物筛选；然后对代谢物与花色参数进行相关性分析（图3）。在S3时期，‘白须朱砂’和‘变绿萼’间有3个差异代谢物，为矢车菊素-3--葡萄糖苷（Cyanidin 3--glucoside）、矢车菊素-3-芸香糖苷（Cyanidin-3-rutinoside）、芍药花素-3--葡萄糖苷（Peonidin-3--glucoside）。3个差异代谢物在‘白须朱砂’与‘变绿萼’间的含量差异同S3时期‘白须朱砂’与‘变绿萼’间a值差异情况一致，且与a值呈正相关关系（表1、图3）。在‘白须朱砂’开花过程中，S1和S2时期筛选到2个差异代谢物（矢车菊素-3--葡萄糖苷和芍药花素-3--葡萄糖苷）；S1和S3时期筛选到3个差异代谢物（矢车菊素-3--葡萄糖苷、芍药花素-3--葡萄糖苷、槲皮素）。结合表1和图3发现，S1—S3时期，这些差异代谢物含量与a*值呈正相关关系，含量变化与表1中a*值逐渐变小的趋势一致（表1、图3）。此外，在S3时期，‘白须朱砂’和‘虎丘晚粉’间筛选到2个差异代谢物，为槲皮素异构体（Quercetin isomer）和槲皮素3--葡萄糖基-2′--鼠李糖苷（Quercetin 3--glucosyl-2′-- rhamnoside）。然而，由表3可以看出，2个差异代谢物在‘虎丘晚粉’与‘白须朱砂’间的含量差异，与表1中S3时期a*值的差异情况相反。同时，根据图3的相关性分析结果，槲皮素异构体与a*相关性不强，槲皮素 3--葡萄糖基-2′--鼠李糖苷与a*呈负相关。

表2 4个梅花品种花瓣中主要黄酮类化合物的HPLC-ESI-MS分析

续表2 Continued table 2

表3 4个梅花品种花瓣中主要黄酮类化合物含量

续表3 Continued table 3

每个正方形表示一对数据的皮尔逊相关系数，热图中蓝色和红色的强度表示正和负的水平相关性。*表示显著相关

‘变绿萼’和‘三轮玉蝶’的S3时期花瓣中筛选出5个差异代谢物，为异鼠李素（Quercetin 3'-methyl ether）、矢车菊素-3-芸香糖苷-5-葡萄糖苷（Cyanidin 3-rutinoside 5-glucoside）、槲皮素-3-芸香糖苷-5-葡萄糖苷（Quercetin-3-rutinoside 5-glucoside）、槲皮素3--葡萄糖苷-7--鼠李糖苷（Quercetin 3--glucoside- 7--rhamnoside）、柚皮素（Naringenin）。结合图3和表3发现，除异鼠李素外，其他4个差异代谢物在‘三轮玉蝶’与‘变绿萼’间的含量差异同表1中S3时期的b*值差异情况一致，且与b*值呈正相关关系（表1、图3）。在‘变绿萼’开花3个时期，根据VIP值≥1和＜0.05，25种代谢物中没有筛选出在‘变绿萼’3个开花时期间存在显著差异的代谢物。

3 讨论

3.1 首次在不同花色梅花品种中鉴定类黄酮化合物

花色是梅花极其重要的观赏性状。类黄酮化合物是影响梅花呈色的主要色素，前人对梅花花瓣中花青素苷进行了鉴定，初步探究了花青素苷对梅花红色花色形成的影响。但梅花花色丰富，除了红、白花色，还有黄绿色，且梅花花瓣中其他类黄酮化合物尚无系统鉴定。本研究首次用LCMS法对不同花色梅花花瓣中类黄酮代谢物进行鉴定。共鉴定出花青素类包括矢车菊素及其衍生物3种，芍药花素衍生物1种，包括了张芹[6]在红色系梅花中鉴定出的花青素成分。另外，本研究首次鉴定出了槲皮素-3-芸香糖苷-5-葡萄糖苷、槲皮素3--葡萄糖苷-7-鼠李糖苷、芹菜素7--葡萄糖苷。

另外，前人研究表明，作为药食同用药材绿萼梅花瓣中含有多种化学成分，其中绿原酸类和黄酮类是其主要活性成分[18]。植物中黄酮类衍生物提取物有促进动物淋巴血液循环的作用，具有镇静、安抚的效果，可舒缓、收敛、抗菌。其中，芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素、山柰酚、异鼠李素具有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗抑郁、抗炎等作用[19-20]。本研究通过对来自不同梅花品种群不同花色的梅花类黄酮化合物进行定性定量分析，发现除了‘变绿萼’，在花色较深的‘白须朱砂’与‘虎丘晚粉’中上述功能化合物的含量也较高，为梅花资源开发提供了参考。

3.2 矢车菊苷和芍药花苷影响梅花红色花色的形成

矢车菊素与芍药花素一般使植物呈现红色，飞燕草素衍生物一般使植物呈现蓝色到紫色[27]。本研究中红色的‘白须朱砂’和紫红色的‘虎丘晚粉’都以矢车菊素及其衍生物、芍药花素及其衍生物为主要成分，矢车菊素及其衍生物、芍药花素及其衍生物在纯白的‘三轮玉蝶’和黄绿色的‘变绿萼’中含量极少。与前人研究报道梅花花色色素属于黄酮类化合物，花青素苷是梅花花色形成的重要色素，梅花的红色花色源于花色素和其苷，且红色程度与其花色苷含量成正相关的结论一致[28]。通过两两对比差异代谢物，‘白须朱砂’和‘变绿萼’在S3时期的差异代谢物矢车菊素-3--葡萄糖苷、矢车菊素-3--芸香糖苷、芍药花素-3--葡萄糖苷在‘白须朱砂’中含量显著高于‘变绿萼’与‘三轮玉蝶’（＜0.05），这也说明矢车菊素衍生物、芍药花素衍生物是影响梅花红、白花色差异的主要因素。同时，S3时期，‘白须朱砂’中花青素总含量、矢车菊素及其衍生物总含量、芍药花素及其衍生物总含量显著高于‘虎丘晚粉’（表3）。另外，S1—S3时期，‘白须朱砂’红色变浅，矢车菊素及其衍生物和芍药花素及其衍生物作为主要成分从S1—S3时期含量显著下降（＜0.05，表3），但S2—S3时期差异变化不明显。同时，差异代谢物矢车菊素-3--葡萄糖苷、芍药花素-3--葡萄糖苷从S1—S3含量显著下降，根据相关性分析发现，矢车菊素-3--葡萄糖苷和芍药花素-3--葡萄糖苷与a*值呈显著正相关（图3）。因此，芍药花苷和矢车菊苷可能是影响‘白须朱砂’红色变化的主要代谢物质，且在‘白须朱砂’开花过程中，芍药花苷和矢车菊苷含量的下降，使‘白须朱砂’花瓣中主要色素占比变化，从而导致红色变浅。

3.3 槲皮素及其衍生物可能是形成梅花黄绿色花色的重要色素

花青素苷是主要的着色物质，黄酮醇是不同颜色的辅助色素[29-30]。黄绿色‘变绿萼’和纯白色‘三轮玉蝶’花瓣中主要类黄酮物质为槲皮素，且‘变绿萼’花瓣中槲皮素-3-芸香糖苷-5-葡萄糖苷、槲皮素-3--葡萄糖苷-7--鼠李糖苷的含量显著高于‘三轮玉蝶’花瓣中的含量（表3）。前人在对金花茶花瓣的研究中发现槲皮素-3-芸香糖苷-5-葡萄糖苷、槲皮素-3--葡萄糖苷-7--鼠李糖苷是花瓣黄色的主要成分，这两种成分含量的积累导致花色变黄[31]。因此，槲皮素-3-芸香糖苷-5-葡萄糖苷、槲皮素-3--葡萄糖苷-7--鼠李糖苷可能是黄绿色梅花育种值得关注的化合物。另外，花青素上游的类黄酮代谢物的组成和含量也与植物着色有关[32]，本研究中柚皮素、异鼠李素在‘三轮玉蝶’与‘变绿萼’S3时期花瓣中存在显著差异（＜0.05；VIP≥1）。

此外，从S1—S3时期，‘变绿萼’黄绿色变浅，与黄色相关的颜色参数b值显著下降，但没有筛选出差异物质，同时与‘变绿萼’花色相关的槲皮素衍生物在S1—S3时期含量无显著变化。前人研究发现黄绿色的绿萼梅不含叶绿素，并推测绿白花色可能与人的视觉习惯有关，花色事实上为黄白甚至纯白[33]。另外，本研究只对‘变绿萼’的类黄酮化合物进行了定性分析，并没有对与植物黄色相关的类胡萝卜素进行定性分析，因此，S1—S3时期观察到‘变绿萼’黄绿色变浅也可能与类胡萝卜素含量变化有关。

4 结论

本研究选择了4个梅花代表花色品种与3个不同开花阶段，利用LCMS首次同时检测了梅花花青素苷和类黄酮苷，共检测到25种类黄酮化合物。通过与‘变绿萼’梅中类黄酮化合物种类与含量比对，发现花色较深的‘白须朱砂’梅与‘虎丘晚粉’梅也含具有抗氧化活性等价值的类黄酮化合物且含量较高。另外，通过探究类黄酮化合物种类及含量与梅花花色的关系，发现矢车菊素及其衍生物和芍药花素及其衍生物是影响梅花花色形成的主要色素；而槲皮素及其衍生物可能是影响黄绿色‘变绿萼’形成的主要色素。

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[3] 陈俊愉. 中国梅花品种图志. 北京: 中国林业出版社, 2010.

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Determination and Analysis of Flavonoids Metabolites in Different Colors Cultivars and Blooming Stages of

College of Horticulture and Forestry Sciences, Huazhong Agricultural University/ National Key Laboratory for Germplasm Innovation & Utilization of Horticultural Crops, Wuhan 430070

【Objective】Flower color is an extremely important ornamental trait of(), and flavonoids are the main pigments in the petals of.However, there are few systematic studies on the composition of flavonoids and the relationship between flower color and flavonoids in. The study on flavonoids can provide a reference for the mechanism of flower color formation and the development of flavonoids resources in.【Method】In this study, the petals of fourcultivars with representative flower color in the blooming stage and the key period of flower color change of two cultivars were selected as materials. The flower color phenotype of petals was measured with the Royal Horticultural Society Color Card (RHSCC) and colorimeter. Flavonoids in those petals of flowers were determined by high-performance liquid chromatography and mass spectrometric (HPLC-MS) detectors. Then, Duncan test and OPLS-DA were used to analyze the difference of metabolites among these four cultivars and the major blooming stages. 【Result】In total, 25 flavonoids were determined in. The main components of red Baixu Zhusha and purple-red Huqiu Wanfen were anthocyanins. But the contents of cyanidin and its derivatives between Baixu Zhusha and Huqiu Wanfen were different. In addition, from the big budding stage to the blooming stage, the red color of Baixu Zhusha gradually became lighter, and the contents of cyanidin-3--glucoside and peonidin-3--glucoside also gradually decreased. Yellow-green Bian Lv’e and pure white Sanlun Yudie were most enriched with quercetin and its derivatives. The contents of quercetin derivatives between Bian Lv’e and Sanlun Yudie were different. 【Conclusion】The flavonoid metabolic profiles differed among the different colored petal of, and flavonoids with medicinal value were distributed in all varieties. The difference in the contents of cyanidin and peonidin might be related to petal color differences of red. Quercetin derivatives might affect the color of yellow-green. In this study, the flavonoids metabolites of different colorwere identified and analyzed for the first time, and the differences in flower colorvarieties and the blooming process were preliminarily understood from the metabolic level. The results provided a reference for understanding the difference of flower color formation and development of flavonoid resources of

; flower color; flavonoids; HPLC-Q-TOF-MS

2022-06-20；

2022-08-29

国家重点研发计划（2019YFD1001500）、中央高校基本科研业务费专项基金（2662020YLPY006）

吴思惠，E-mail：wsh_chin@webmail.hzau.edu.cn。通信作者张杰，E-mail：flybebrave@mail.hzau.edu.cn

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.09.012

（责任编辑 赵伶俐）