山竹果皮提取物Garcinone E对鼻咽癌S18细胞迁移和侵袭的影响及相关机制研究

韦 丹, 张 菡, 尹富强, 刘 夏

鼻咽癌是一种起源于鼻咽黏膜的上皮性癌,常见于咽隐窝[1]。鼻咽癌不同于其他头颈部癌,它具有特定的地理分布,高发于我国和东南亚地区,具有较高的远处转移风险[2]。广西的鼻咽癌发病率和病死率位居全国前列[3]。鼻咽癌早期治疗以放疗为主,但常规二维放疗对于晚期患者并不理想,这类患者的5年总生存率低于60%[4]。另外,传统的化疗药物可产生耐药,同步放化疗后晚期患者5年总生存率仍不理想,仅有70%左右[2]。因此,亟需寻找新的抗肿瘤化疗药物以提高晚期患者的生存率。氧杂蒽酮类化合物是一类含氧杂环单体化合物,已有研究表明其具有良好的抗肿瘤作用[5-6]。Garcinone E是从山竹(GarciniamangostanaL.)果皮提取的一种氧杂蒽酮类单体化合物,近期研究表明其在卵巢癌中具有阻断细胞自噬等抗肿瘤作用[7]。Garcinone C与Garcinone E均为氧杂蒽酮类天然化合物,近期有研究报道Garcinone C可以通过抑制结直肠癌细胞侵袭而起到抗肿瘤的作用[8]。本研究旨在探讨Garcinone E对人源鼻咽癌细胞S18的转移、周期及自噬的影响,进一步阐明Garcinone E的抗肿瘤机制,以期为鼻咽癌的治疗提供先导化合物。

1 材料与方法

1.1细胞及主要试剂 鼻咽癌细胞株S18受赠于中山大学肿瘤防治中心钱朝南教授,本课题组实验室保存使用。Garcinone E(分子式为C28H32O6)由深圳市中国科学院仙湖植物园管理处冯世秀博士从山竹(GarciniamangostanaL.)果皮中分离、提取、纯化,并赠予本课题组进行科研用途[9]。DMEM高糖培养基、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)购自加拿大WISENT公司。0.25%胰蛋白酶、青霉素、链霉素、结晶紫溶液购自北京索莱宝公司。CCK-8试剂盒购自北京兰杰柯公司;BCA蛋白定量试剂盒购自上海碧云天公司;ECL化学发光液购自美国Thermo Scientific公司。无基质胶Transwell小室、含基质胶Transwell小室购自美国Corning公司。一抗:组织金属蛋白酶抑制剂1(tissue inhibitor of metalloproteinase 1,TIMP1),组织金属蛋白酶抑制剂2(tissue inhibitor of metalloproteinase 2,TIMP2),基质金属蛋白酶2(matrix metallopeptidase 2,MMP-2),基质金属蛋白酶9(matrix metallopeptidase 9,MMP-9),细胞周期依赖性蛋白激酶抑制因子1A(cyclin-dependent kinase inhibitor 1A,p21),周期蛋白依赖性激酶2(cyclin-dependent kinase 2,CDK2),周期蛋白依赖性激酶6(cyclin-dependent kinase 6,CDK6),周期蛋白依赖性激酶7(cyclin-dependent kinase 7,CDK7),细胞周期蛋白B1(cyclin B1),微管相关蛋白1轻链3 β(microtubule-associated protein 1 light chain 3 beta,LC3B),泛素结合蛋白p62(ubiquitin-binding proteinp62,SQSTM1/p62),苄氯素1(beclin-1),自噬相关蛋白3(autophagy-related 3,Atg3),均购自美国Cell Signaling Technology公司。辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗(anti-rabbit IgG),辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠二抗(anti-mouse IgG)均购自美国Cell Signaling Technology公司。内参蛋白抗体:甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH),微管蛋白β(microtubulin beta,β-tubulin)均购自杭州弗德公司。

1.2主要仪器 荧光倒置显微镜(日本,Olympus公司,型号:BX53),恒温细胞培养箱(美国,Thermo Fisher Scientific公司,型号:3111),低温高速离心机(德国,Eppendorf公司,型号:5424R),全波长酶标仪(美国,Thermo Scientific公司,型号:Multiskan GO),BD电泳仪(美国,Bio Rad公司,型号:PowerPac Basic),化学发光成像仪(中国赛智创业公司,型号:MiniChemi 610 Plus)。

1.3细胞培养 S18细胞使用含有10%FBS和1%的青霉素和链霉素的DMEM完全培养基在37 ℃、5% CO2的饱和湿度恒温细胞培养箱中进行培养,细胞长到75%～85%汇合度时进行传代。

1.4细胞活力检测 取对数生长期的S18细胞,以250 cells/孔种于96孔板中。设置Garcinone E浓度梯度:0、0.78、1.56、2.187、3.125、4.375、6.25、8.75、12.5、17.5 μmol/L,孵育96 h后撤去旧培养基,每个孔中分别加入100 μl新鲜的DMEM培养基和10 μl的CCK-8试剂,在37 ℃条件下避光孵育1 h后上机检测450 nm处的OD值。相对细胞活力(%)=药物处理组OD值/对照组(0 μmol/L Garcinone E)OD值×100%。

1.5S18细胞迁移实验 使用不含基质凝胶的Transwell小室进行细胞迁移实验,观察细胞的迁移能力。在下室中加入750 μl DMEM完全培养基。将S18细胞培养至对数生长期,消化、离心后弃上清液,用未加FBS的DMEM培养基重悬,取500 μl细胞悬液接种到上室中,使用7.5 μmol/L的Garcinone E干预细胞。24 h后,弃去上室及下室旧液,用杜氏磷酸盐缓冲盐溶液(Dulbecco′s phosphate buffered saline,D-PBS)清洗2次,取750 μl的4%多聚甲醛于下室进行固定,20 min后弃旧液,用D-PBS清洗2次,取750 μl的0.1%结晶紫染液进行染色,20 min后弃旧液,用D-PBS洗2遍,用棉签轻柔擦去上室中未迁移的细胞。在显微镜下观察拍照,用Image J软件统计迁移的细胞数。进行3次独立重复实验。细胞迁移率=Garcinone E干预组细胞迁移数/对照组细胞迁移数×100%。

1.6S18细胞侵袭实验 使用含基质凝胶的Transwell小室模拟体内细胞外基质,进行细胞侵袭实验,检测细胞的侵袭能力。实验方法与上述方法1.5类似,但在处理细胞前,需在含基质凝胶的上室及下室中分别加入500 μl和750 μl无FBS的DMEM培养基进行水化,在37 ℃恒温条件下处理2 h,后将细胞接种于Transwell小室中。24 h后,先用无FBS的DMEM培养基湿润棉签,轻柔擦去上室中未穿过的细胞,再进行染色、固定。进行3次独立重复实验。细胞侵袭率=Garcinone E处理组细胞侵袭数/对照组细胞侵袭数×100%。

1.7Western blot检测S18细胞转移、周期和自噬相关蛋白表达水平 设置3个复孔,以不同浓度Garcinone E(0、5、7.5、10 μmol/L)干预S18细胞24 h后,用含有蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂和EDTA的RIPA裂解液裂解细胞,用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。通过12%的SDS-PAGE凝胶电泳1.5 h分离蛋白,90 V恒压电压转膜3 h,5%脱脂奶粉封闭1 h,1×TBST洗膜后孵育一抗,4 ℃过夜。第2天室温孵育二抗1 h,用ECL化学发光液孵育1 min后使用凝胶成像系统显影,设置合适的曝光时间以获取目的蛋白的条带图像。相对表达量(%)=药物干预组内参归一化的灰度值/对照组内参归一化的灰度值×100%。

2 结果

2.1Garcinone E抑制S18细胞的增殖活性的实验结果 细胞活力检测实验结果显示,Garcinone E抑制S18细胞的增殖活性,S18细胞的细胞活力随着药物浓度的增加而降低,半抑制浓度(fifty percent inhibitory concentration,IC50)=(3.34±0.03)μmol/L。见图1。

图1 不同浓度Garcinone E下S18细胞的增殖活性图

2.2Garcinone E抑制S18细胞的迁移能力的实验结果 Transwell细胞迁移实验结果显示,与对照组相比,Garcinone E干预组细胞迁移率显著下降(t=29.662,P<0.001),提示经Garcinone E干预后,S18细胞的迁移能力被抑制。见图2。

图2 两组S18细胞迁移能力比较图(结晶紫染色,×200)

2.3Garcinone E抑制S18细胞的侵袭能力的实验结果 Transwell细胞侵袭实验结果显示,与对照组相比,Garcinone E干预组S18细胞侵袭率显著下降(t=13.716,P<0.001)。提示经Garcinone E干预后,S18细胞的侵袭能力被抑制。见图3。

图3 两组S18细胞侵袭能力比较图(结晶紫染色,×200)

2.4Garcinone E对S18细胞转移相关蛋白表达影响的实验结果 Western blot实验结果显示,Garcinone E干预后S18细胞TIMP1和TIMP2蛋白表达水平上调(P<0.05),MMP-2和MMP-9蛋白表达水平下调(P<0.05),且呈一定的剂量依赖性。见图4。

经单因素方差分析,与对照组比较,aP<0.05;与5 μmol/L组比较,bP<0.05;与7.5 μmol/L组比较,cP<0.05

2.5Garcinone E对S18细胞周期相关蛋白表达影响的实验结果 Western blot实验结果显示,Garcinone E干预后S18细胞p21蛋白表达水平上调(P<0.05),CDK2、CDK6、CDK7和cyclin B1蛋白水平下调(P<0.05),且呈一定的剂量依赖性。见图5。

经单因素方差分析,与对照组比较,aP<0.05;与5 μmol/L组比较,bP<0.05;与7.5 μmol/L组比较,cP<0.05

2.6Garcinone E对S18细胞自噬相关蛋白表达影响的实验结果 Western blot实验结果显示,Garcinone E干预后S18细胞LC3B-Ⅱ、SQSTM1/p62、beclin-1和Atg3蛋白表达水平均上调(P<0.05),且呈一定的剂量依赖性。见图6。

经单因素方差分析,与对照组比较,aP<0.05;与5 μmol/L组比较,bP<0.05;与7.5 μmol/L组比较,cP<0.05

3 讨论

3.1在鼻咽癌的治疗中,肿瘤的转移和耐药使得临床治疗极具挑战性[10],因此亟需寻找新的抗肿瘤化疗药物。氧杂蒽酮是一大类化合物,具有多种生物活性,包括抗肿瘤[11]、抗炎症[12]和抗真菌[13]等。近期的研究报道表明,其可通过抑制肿瘤细胞的转移[6]、促进肿瘤细胞的凋亡[14]、抑制肿瘤细胞周期[15]以及阻断肿瘤细胞自噬[7]等过程起到抗肿瘤作用。本研究结果显示,Garcinone E可以抑制鼻咽癌S18细胞的增殖活性、转移、细胞周期并阻滞细胞自噬。

3.2基质金属蛋白酶家族(matrix metallopeptidases,MMPs)是一组组织重塑酶,主要功能是组织重塑和调节细胞外基质,在肿瘤细胞的迁移和侵袭过程中发挥重要作用[16]。组织金属蛋白酶抑制剂家族(tissue inhibitors of metalloproteinases,TIMPs)的主要功能是对MMPs产生抑制作用,通过直接结合到催化性锌元素辅因子,使MMPs不可逆地失活。TIMP1是MMP-9最有效的抑制剂,TIMP2在大部分组织中有表达,可抑制MMP-2和MMP-9,形成非活性的MMPs-TIMPs复合体[17]。MMP-2和MMP-9作为侵袭相关的标志蛋白,Garcinone C通过下调结直肠癌中的MMP-2和MMP-9蛋白水平起到抑制其侵袭的作用[8]。有研究显示,积雪草酸和柚皮素联合治疗可以通过上调TIMP2和下调MMP-2蛋白表达抑制黑色素瘤和肺癌小鼠模型中肿瘤的侵袭和转移[18]。骨化三醇(维生素D的活性形式)处理乳腺癌细胞后,TIMP1和TIMP2蛋白表达上调,MMP-2和MMP-9蛋白表达下调,显著抑制乳腺癌细胞的迁移和侵袭[19]。本研究结果显示,Garcinone E可以上调S18细胞TIMP1和TIMP2蛋白表达水平,下调MMP-2和MMP-9蛋白表达水平,提示Garcinone E可以通过下调MMP-2和MMP-9表达而抑制鼻咽癌细胞的迁移和侵袭。

3.3细胞周期进程异常是肿瘤发生的基本机制之一,使得细胞周期机制的调节剂成为抗肿瘤治疗靶点[20]。细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinases,CDKs)是真核细胞周期的主要调节剂,肿瘤抑制因子p21是CDKs的抑制剂,在细胞周期控制中发挥重要作用[21]。有研究显示,白花丹素(Plumbagin)通过上调p53和p21的表达,下调CDKs阻断子宫内膜癌Ishikawa细胞周期并抑制了细胞的增殖[22]。他汀类药物通过上调p21和下调CDKs及细胞周期蛋白cyclins的表达阻滞口腔鳞状细胞癌细胞周期[23]。本研究结果显示,Garcinone E可以上调p21蛋白表达,下调CDK2、CDK6、CDK7和cyclin B1蛋白表达,抑制S18细胞增殖活性,提示Garcinone E具有阻滞鼻咽癌细胞周期的作用。

3.4细胞自噬是一种细胞内的自我降解机制,是对环境压力或饥饿条件作出的反应,可以降解自身的大分子物质和受损的细胞器以维持细胞内稳态。越来越多的研究表明,自噬在肿瘤发生发展中具有重要作用。在肿瘤发展的晚期,自噬可能通过在营养受限或其他应激时提供能量底物来维持和刺激肿瘤的生长,自噬已成为对放疗、化疗和靶向药物产生抗性的重要介质[24]。许多研究表明,阻断细胞自噬可能成为治疗肿瘤的有效策略[25-26]。LC3是自噬发生过程的标志蛋白,通常表现为从细胞质LC3-Ⅰ到脂质化的LC3-Ⅱ的分子形式转化,被募集到吞噬体并停留在自噬体的内膜上,直到在自噬溶酶体中降解[27]。SQSTM1/p62会在自噬过程中降解,当自噬过程被阻断时,LC3-Ⅱ和SQSTM1/p62会累积。CA-5f是一种晚期自噬抑制剂,可以升高LC3B-Ⅱ和SQSTM1/p62的蛋白水平,阻滞非小细胞肺癌细胞的自噬通量[28]。本研究结果显示,Garcinone E可以上调LC3B-Ⅱ和SQSTM1/p62水平,提示Garcinone E可以阻断S18细胞自噬过程。

综上所述,Garcinone E通过抑制MMP-2和MMP-9的表达,抑制鼻咽癌S18细胞的迁移和侵袭,同时可以阻滞细胞周期和细胞自噬的过程,从而发挥抗肿瘤作用,可作为鼻咽癌化疗药物研发的候选先导化合物。