外排泵抑制剂对耐药痤疮丙酸杆菌的体外作用

毛海婵,郑武娟,曾文军,杨丽玲,李明,阮建波

痤疮是一种毛囊皮脂腺单位的慢性炎症性皮肤病,好发于青春期,且具有损容性[1]。2021年,中国一项对中学生的流行病学调查显示痤疮现患率高达60.21%[2]。痤疮丙酸杆菌(Cutibacteriumacnes,C.acnes)是痤疮重要发病机制之一,以抗生素治疗来降低皮损中C.acnes种群密度,从而达到治疗效果,获得《中国痤疮治疗指南》推荐[1]。自1960年由美国首次报道分离出C.acnes至抗生素被广泛应用于痤疮治疗,其耐药性问题日益显著。C.acnes的抗生素耐药现象,以大环内酯类和林可酰胺类耐药问题较为突出,且这两类药物抗菌作用机制相似,二者交叉耐药现象较为普遍[3]。国内一项Meta分析[4]显示,痤疮丙酸杆菌对大环内酯类的红霉素、克拉霉素和阿奇霉素耐药率分别为45%、74%和59%,林可酰胺类的克林霉素耐药率高达88%。既往文献报道细菌对大环内酯类抗生素耐药可能与外排泵相关,使用外排泵抑制剂可降低细菌对大环内酯类药物红霉素、克拉霉素和泰利霉素的耐药性[5]。为此,本研究收集临床分离的痤疮丙酸杆菌,使用外排泵抑制剂羰基氰氯苯腙(Carbonyl cyanide-3-chlorophenylhydrazone,CCCP)和(苯丙氨酸-精氨酸-β-萘酰胺(phenylalanine-arginine β-naphthylamide,PAβN)联合大环内酯-林可酰胺类抗菌药物进行药物敏感性试验,测定最小抑菌浓度,观察外排泵抑制剂是否影响痤疮丙酸杆菌的耐药性,以期通过外排泵抑制剂降低C.acnes对大环内酯-林可酰胺类抗生素的耐药性。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株C.acnes标准株:ATCC11827,购于广东省微生物菌种保藏中心。C.acnes临床分离株39株:2015年6月—2016年10月来自暨南大学附属东莞医院痤疮患者皮损处收集样本。

1.1.2试剂与仪器 红霉素(ERY)、阿奇霉素(AZM)、林可霉素(LIN)和克拉霉素(CLA)(中国食品药品检定研究院),盐酸克林霉素(CLI)(美国洛杉矶PANPHY化学公司),CCCP和PAβN(美国Sigma公司)。VITEK MS plus质谱检测系统(法国生物梅里埃公司),细菌多点接种仪(MIT-P型)(日本株式会社佐久间制所),厌氧培养罐(AJ9050型)和多功能微生物培养系统(Multi-Purpose Incubator型)(广州市尤德生物科技有限公司),标准混合气体装置(CO2:10%,H2:10%,N2:80%)(大连大特气体有限公司),麦氏比浊度仪(BIOMERIEUX DensiCHEK Plus)。

1.2方法

1.2.1菌株复苏鉴定 从-70 ℃冰箱中取出菌种,复苏后进行厌氧血琼脂平板培养、菌落形态判断、革兰染色镜检、纯化培养及VITEK MS plus质谱分析[6],质谱评分大于2.0为鉴定至种水平。

1.2.2药敏试验 按照琼脂稀释法[7],对大环内酯类(红霉素、阿奇霉素、克拉霉素)和林可酰胺类(克林霉素、林可霉素)设置0.062 5、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64、128、256 μg/mL浓度梯度布氏血琼脂平板进行药敏试验。

1.2.3外排泵抑制试验 根据药敏结果分多重耐药组、单一耐药组进行外排泵抑制试验。按照琼脂稀释法[7],以外排泵抑制剂联合抗菌药物:CCCP+红霉素,PAβN+红霉素,CCCP+阿奇霉素,PAβN+阿奇霉素,CCCP+克拉霉素,PAβN+克拉霉素,CCCP+克林霉素,PAβN+克林霉素,CCCP+林可霉素,PAβN+林可霉素。每种抗生素浓度设置0.062 5、0.125、0.25 、0.5、1、2、4、8、16、32、64、128、256 μg/mL (共13个浓度)制备布氏血琼脂平板。外排泵抑制剂浓度使用10 μg/mL参考文献[8]。

1.2.4MIC值 调节菌液浊度为0.5麦氏浊度(相当于105CFU/点),使用多点接种仪从低浓度到高浓度依次接种含抗菌药物系列稀释浓度平板,接种前后各需接种两个空白对照平板。待平板吸收接种物后,置于厌氧培养罐内,放入厌氧指示剂和催化剂,密闭罐体,使之连接多功能微生物培养系统,待罐内达到厌氧环境,置于36 ℃恒温箱孵育48 h,测定药物MIC值。

1.2.5结果判读 药敏试验:抗菌药物解释标准参照CLSI《Methods for antimicrobial susceptibility testing of anaerobic bacteria, approved standard seventh edition》[7]。多重耐药菌株指对两种或以上大环内酯-林可酰胺类抗生素耐药;单一耐药菌株指仅对一种大环内酯-林可酰胺类抗生素耐药;敏感菌株指对大环内酯-林可酰胺类抗生素(红霉素、阿奇霉素、克拉霉素、克林霉素、林可霉素)均敏感;外排泵抑制试验:先观察只含外排泵抑制剂的平板中细菌的生长是否有抑制作用。再观察外排泵抑制剂联合抗菌药物的平板,药物MIC值是否降低。外排泵抑制剂联合抗菌药物的MIC结果判读参照药敏试验的步骤。以联合外排泵抑制剂后,抗菌药物MIC值降低≥4倍为外排泵表型阳性菌[8-9],即MIC值至少降低两个浓度梯度。

2 结果

2.1鉴定结果 39株前期收集的冻存菌株,经复苏、培养、纯化、革兰染色镜检、质谱鉴定,结果均为C.acnes(质谱鉴定得分均>2.0,细菌均鉴定至种水平)。

2.2药敏试验结果 39株C.acnes的大环内酯-林可酰胺类药物药敏试验结果,MIC值详见表1。耐药菌29株(74.36%),包括多重耐药菌株27株(69.23%)和单一耐药菌株2株(5.13%);敏感菌株10株(25.64%)。

表1 痤疮丙酸杆菌对大环内酯-林可酰胺类抗生素的MIC值分布情况 (μg/mL,n=39)

2.3外排泵抑制试验结果 多重耐药组:CCCP+阿奇霉素筛选出5株外排泵表型阳性菌株,CCCP+克拉霉素筛选出2株外排泵表型阳性菌株(菌株编号为27号、38号,这两株菌株包含在前述以阿奇霉素为外排底物的外排泵阳性的5株菌中),CCCP+红霉素、克林霉素、林可霉素时,菌株外排泵表型均为阴性;PAβN+克拉霉素筛选出2株外排泵表型阳性菌株(菌株编号为38号、91号,此38号菌株与CCCP+克拉霉素外排泵阳性菌株38号菌株一致),PAβN+红霉素、阿奇霉素、克林霉素、林可霉素时,菌株外排泵表型均为阴性。外排泵表型阳性菌株其MIC值变化见表2～3。其中38号菌以克拉霉素为底物时,联合CCCP或PAβN的MIC值均由128 μg/mL降至16 μg/mL。另外,存在部分菌株MIC值仅降低2倍,CCCP+红霉素有3株菌(MIC值由>256 μg/mL降至256 μg/mL)、CCCP+克拉霉素有1株菌(>256 μg/mL降至256 μg/mL)、PAβN+红霉素有1株菌(256 μg/mL降至128 μg/mL)、PAβN+克林霉素有7株菌(128 μg/mL降至64 μg/mL)。CCCP或PAβN+林可霉素,药物MIC未发生变化。单一耐药组:以两种外排泵抑制剂分别联合5种抗生素后MIC值未发生变化,菌株外排泵表型均为阴性。

表2 使用CCCP前后外排泵表型阳性菌株MIC (μg/mL)

表3 使用PAβN前后外排泵表型阳性菌株MIC (μg/mL)

3 讨论

痤疮是皮肤科常见病,C.acnes通过天然免疫和获得性免疫参与了痤疮的发生发展,是痤疮重要发病机制之一[1]。然而,近十年来,国内不断有C.acnes的耐药报道[4]。本研究中39株临床分离的痤疮丙酸杆菌对大环内酯-林可酰胺耐药率为74.36%(29/39),与2019年国内一项痤疮患者皮损中痤疮丙酸杆菌对抗生素耐药性的Meta分析报道高耐药率结果相似[4]。C.acnes高耐药性的产生,可导致痤疮治疗失败、皮肤微生物菌群紊乱、局部和系统条件致病菌感染和耐药株传播等不良影响[10]。因此,降低C.acnes耐药性对痤疮治疗具有重要意义。

细菌对大环内酯-林可酰胺类耐药的机制主要有三种:①外排泵;②灭活酶;③基因变异或携带耐药基因。既往关于痤疮丙酸杆菌对大环内酯-林可酰胺类耐药的机制主要集中于耐药基因ermX和23S rRNA点突变[11]。然而,罕见C.acnes外排泵相关耐药机制报道。外排泵是在细菌细胞膜上的一些转运膜蛋白,这些膜蛋白通过主动耗能改变自身构象,将药物选择性或非选择性地泵出细菌细胞外,使达到作用靶位的抗菌药物浓度显著降低而导致细菌耐药[12]。通过使用外排泵抑制剂可抑制外排泵的活性,达到降低耐药菌株耐药性的效果,CCCP与PAβN是目前使用较多的外排泵抑制剂。CCCP是一种氧化磷酸化抑制剂,是线粒体质子载体解偶联剂,可增加线粒体膜对质子的通透性,从而破坏线粒体膜电位,使外排转运系统因能量缺乏而主动外排作用受限,导致抗菌药物在菌体内蓄积,从而提高细菌对抗菌药物的敏感性[13]。PAβN则通过竞争性结合转运蛋白上的结合位点,以阻止进入细菌内的抗菌药物及其他底物与该位点的结合,减少药物的外排,使细菌内药物浓度不受外排泵的影响,提高抗菌药物的效果[14]。

本研究采用CCCP和PAβN两种外排泵抑制剂,分别联合大环内酯类(红霉素、阿奇霉素、克拉霉素)及林可酰胺类(克林霉素、林可霉素)进行外排泵抑制试验,发现在多重耐药组C.acnes中存在外排泵表型阳性菌株:以CCCP+阿奇霉素筛选出5株外排泵表型阳性菌株,MIC值由>256 μg/mL降至<0.062 5 μg/mL,细菌由耐药变为敏感;CCCP+克拉霉素筛选出2株外排泵表型阳性菌株(编号为27、38号包含在前述5株菌中)。其中27号、38号菌在CCCP作用下,阿奇霉素、克拉霉素的MIC值降低≥4倍,说明CCCP对这两株菌的外排转运阿奇霉素和克拉霉素的外排泵具有显著的抑制作用。与Deng等[15]报道结果相似,CCCP对筛选外排泵阳性菌株及降低菌株耐药性方面较PAβN更有优势。本研究PAβN+克拉霉素也筛选出2株菌外排泵表型阳性菌株,但与CCCP+克拉霉素筛选的菌株不完全一致,其中38号菌是共有的,均表现出外排泵抑制现象。38号菌在PAβN作用下,克拉霉素的MIC值由128 μg/mL降至16 μg/mL,但阿奇霉素的MIC值并未发生变化,提示CCCP对外排泵的抑制作用较PAβN更广谱,这可能与CCCP和PAβN的作用机制不同相关,CCCP作为一种氧化磷酸化抑制剂,广泛影响外排泵的能量供应从而抑制外排泵作用,而PAβN则需竞争性结合某种转运蛋白上的结合位点才能起抑制作用。

本研究发现耐药性C.acnes中存在外排泵导致耐药,外排泵抑制剂CCCP和PAβN能一定程度上降低多重耐药痤疮丙酸杆菌对大环内酯-林可酰胺类抗生素的耐药性。但文献报道的外排泵系统种类繁多、机制复杂,不同细菌对同种抗生素或同种细菌对不同抗生素的外排作用可由不同的外排泵参与[12],未来研究重点是痤疮丙酸杆菌的多重耐药与哪些外排泵相关,总而言之,本研究为解决C.acnes耐药的药物开发提供一定参考。