串联质谱技术在新生儿遗传代谢病筛查中的应用研究进展

赵娜

[ 关键词] 串联质谱；新生儿；筛查；遗传代谢病；氨基酸；酰基肉碱

[ 中图分类号] R722.1 [ 文献标识码] A [ 文章编号] 2095-0616（2023）08-0051-04

遗传代谢病（inherited metabolic disorders，IMD）以常染色体遗传为主，由于基因突变，使得其编码的受体、酶、膜蛋白或运载蛋白的结构或功能发生变化[1-2]，从而使生物合成造成缺陷，导致糖、脂肪、蛋白和微量元素代谢障碍，使得必要代谢产物合成不足或毒副产物过度堆积，是一种多脏器疾病[3-5]。IMD 临床表现缺乏特异性，多见代谢紊乱、心功能异常、呕吐、神经异常、肝功能异常、肾功能异常，一些患儿伴皮肤和毛发颜色异常、容貌异常、眼部异常、特殊尿味、昏迷、肌张力低、酸中毒或高血氨等。该病可造成患儿严重的生长发育障碍和智力低下，影响神经和消化系统，具有致死性，给患者及其家庭带来了极大的经济和精神负担。在中枢系统发育之前或出现严重症状之前，如果不能给予有效治疗，该病难以达到理想的治疗效果[6-7]。IMD 包括氨基酸代谢异常、有机酸代谢障碍、脂肪酸代谢紊乱等，同样的IMD 病种的表型会有较大差异，不同病种也会有相似的临床表现，因此诊断有难度。随着基因诊断技术的普及，临床医生对IMD 的识别能力迅速提高，迄今已发现1000 余种IMD，虽然单一病种的发病率不高，但总体发病率较高[8-9]。据统计，IMD 总体患病率已高达1/3000 ～ 1/6000[10]，是出生缺陷的重要原因。其中很多病种可以通过饮食控制和调整、药物、移植等手段达到接近正常人的生存质量，因此早期筛查和诊断尤为重要。

1 IMD概况

IMD 按照分子量划分，可以分为大分子病和小分子病，其中大分子病包括线粒体病，溶酶体贮积症等，小分子病包括氨基酸代谢障碍、有机酸代谢障碍、脂肪酸代谢异常。其中，小分子病的筛查和诊断可以通过检测血液中氨基酸、肉碱等指标的浓度来实现。目前已发现的IMD 种类逐渐增多，单一病种发病率不高，IMD 的发病率在全国各地区也各不相同，疾病种类也不相同，据报道[11]，氨基酸代谢异常疾病发病率为1/13 800、脂肪酸代谢异常疾病发病率为1/10 400、有机酸代谢异常发病率为1/14 700。

氨基酸代谢异常，也称氨基酸血/ 尿症，是因为氨基酸代谢异常而造成的一组疾病，蛋白质代谢路径中需要关键酶的作用，当基因突变导致这些酶的功能发生损伤时，造成氨基酸合成和分解代谢障碍，均为常染色体隐性遗传[12]。氨基酸代谢病通常对子宫内胎儿的生长发育不产生影响，早期只表现出轻度的精神和运动方面的发育迟缓，一般无体征，直到几年后才有明显症状。典型疾病包括苯丙酮尿症、高鸟氨酸血症、高甲硫氨酸血症、枫糖尿病、同型半胱氨酸血症、瓜氨酸血症、四氢生物蝶呤缺乏症、精氨酸酶缺乏症等，疾病筛查实验通过对血中氨基酸例如苯丙氨酸（phenylalanine，PHE）、瓜氨酸（citrulline，CIT）、酪氨酸（tyrosine，TYR）、鸟氨酸（ornithine，ORN）、甲硫氨酸（methionine，MET）、亮氨酸（leucine，LEU）、精氨酸（arginine，ARG）浓度测定以及比值实现疾病筛查。其中，苯丙酮尿症的患病率是我国新生儿筛查疾病中患病率最高的，达1/11 144[13]。该病早期无明显体征，但随着患儿年龄的增长，临床症状逐渐明显，患儿智商低下，且是不可逆的，可见新生儿IMD 筛查是出生缺陷预防的重要防线[14]。

有机酸代谢异常，也称有机酸血/ 尿症，是由于氨基酸代谢、脂肪酸氧化、糖代谢途径中需要的某些酶的异常缺陷，导致在分解代谢过程中产生的代谢产物有机酸在体内增加、蓄积，从而造成神经系统及其他多器官的损害，严重时会表现出代谢性酸中毒、低血糖、高血氨等症状。甲基丙二酸血症是有机酸代谢病中最常见的，其次是丙酸血症、异戊酸血症、戊二酸血症Ⅰ型、3- 甲基巴豆酰辅酶A 羧化酶缺乏症、生物素酶缺乏症等，疾病筛查实验可通过对标本中氨基酸和肉碱例如MET、丙酰肉碱（propionylcarnitine，C3）、C3与乙酰肉碱（acetylcarnitine，C2）比值、异戊酰肉碱（isovalerylcarnitine，C5）、3- 羟基异戊酰肉碱（3-hydroxyisoamylcarnitine，C5-OH）等指标筛查疾病[15]。因此及时进行新生兒IMD 筛查对保证患儿生存质量至关重要。

脂肪酸代谢异常，是由于多种酶的缺陷导致脂类在体内合成分解、消化吸收和转运出现异常的一组代谢缺陷性疾病。临床会表现出人体能量代谢降低，疲乏无力、惊厥、头晕眼花、心律失常、低血糖、发作性饥饿性意识障碍、糖尿病、脑病、肝功能损害、肌病和心肌病，高脂血症等症状，严重者会危及生命，多见于婴幼儿，过去常把这种临床表现误诊为婴儿猝死综合征、Reye 综合征[16-17]。脂肪酸代谢过程中，肉碱和脂肪酸结合形成酰基肉碱，并通过线粒体膜进行氧化供能，因此在应用串联质谱进行筛查时，用酰基肉碱浓度作为脂肪代谢的检测指标。常见的脂肪酸代谢异常有原发性肉碱缺乏症、肉碱棕榈酰转移酶缺乏症、短链酰基辅酶A 脱氢酶缺乏症、中链酰基辅酶A 脱氢酶缺乏症、极长链酰基辅酶A 缺乏症等，疾病筛查实验通过对标本中酰基肉碱例如游离肉碱C0，短链酰基肉碱C2、C3、C4、C5，中链酰基肉碱C6、C8、C10，长链酰基肉碱C12、C14，极长链酰基肉碱C16、C18 等指标浓度进行临床判断。因此临床中有必要对新生儿IMD 进行积极的筛查工作，为疾病发现和及时诊治提供科学依据。

2 IMD筛查国内外研究现状

对IMD 早发现、早诊断、早治疗十分重要。但常规筛查方式，由于疾病、药物或饮食等因素对体内生化代谢物浓度造成影响，因此筛查结果具有很大程度的不确定性。高效液相串联质谱技术能够对血液中多种氨基酸和肉碱进行定性和定量分析，通过氨基酸、肉碱及相应指标的比值，快速筛查和诊断氨基酸、有机酸、脂肪酸代谢异常疾病。这是一种高效率、高特异性、高敏感度的快速检测技术。1961年，美国Guthrie 医生测定滤纸干血片中苯丙氨酸浓度采用细菌抑制法，这种简便且方便运送的检测方法可以应用于开展大规模人群筛查[18]。至今，人们通过新生儿疾病筛查的手段来发现并预防IMD 的危害已有近60 年历史。新生儿疾病筛查技术从细菌抑制法发展到酶联免疫法、时间分辨法、荧光法，但这些检测方法筛查效率不高，一般是一次实验过程只能检测一种疾病。20 世纪80 年代，电喷雾和质谱技术能够对多种氨基酸、酰基肉碱和有机酸进行快速、高效地检测。Millington 等[19] 很快将一次实验检测多种疾病的质谱技术应用于新生儿疾病筛查，将疾病筛查种类扩展到多种，使新生儿疾病筛查得到了飞快发展。早在1990 年，串联质谱技术率先在美国被应用于新生儿代谢病的筛查，目前欧美、日本、韩国、新加坡以及我国台湾等国家和地区，也将串联质谱技术普遍用于新生儿IMD筛查[20-21]。我国于1981 年开始对先天性甲状腺功能减退及苯丙酮尿症的新生儿进行疾病筛查。串联质谱筛查在我国大陆地区开展相对较晚，21 世纪初，我国上海和浙江地区率先将串联质谱技术应用于新生儿IMD 检测，在多种IMD 的筛查、诊断、治疗等方面积累了宝贵的经验[22]。经过多年的探索和发展，中国的新生儿疾病筛查从自发开展发展到系统、有序地规划组织。随着串联质谱技术的发展，人们对IMD 的认识程度越来越高，疾病被发现的种类也逐渐增多。随着IMD 筛查方法敏感度的提高和治疗技术手段的发展，IMD 筛查的病种由苯丙酮尿症一种增加到几十种，近些年在一些发达地区，串联质谱技术也用来筛查X- 连锁肾上腺脑白质营养不良症、溶酶体贮积症等。串联质谱技术的飞速发展为一次实验检测多种疾病的模式提供了高特异性、高敏感度、高选择性的手段。对降低患儿的出生缺陷和病死率、提高出生人口素质，有着重要意义。我国串联质谱技术发展速度飞快，目前在很多地区开展了新生儿疾病筛查串联质谱技术。2018 年，中国新生儿筛查专家组在全国进行了应用高效液相串联质谱法进行新生儿IMD 筛查的调查，统计结果显示总患病率在1/3153[10]，中国仍然面临形势严峻的出生缺陷预防工作。高效液相串联质谱技术必定将成为新生儿疾病筛查的重要手段，对中国提高出生人口素质，出生缺陷防治工作有着重要意义。

3 IMD筛查结果的影响因素

新生儿疾病筛查串联质谱项目是指利用串联质谱技术对新生儿滤纸干血斑中的氨基酸、肉碱及相应比值进行定量检测，然后临床医生根据检测物的浓度水平判断患IMD 的风险程度。串联质谱疾病筛查报告单中包含79 个项目（代谢物指标和代谢物之间的比值），代谢物浓度和比值均有对应的参考范围，对于高于或低于参考范围的浓度指标，都被系统判读为可疑阳性，在报告单中分别用↑和↓标记。阳性率是指可疑阳性的样本数占总样本数的百分比。通过总结发现，阳性率在不同地区间存在较大差异，同一地区不同指标阳性率也存在较大差异，同一地区同一指标在不同时间也可能存在差异。本文体现了新生儿IMD 筛查指标切值建立方法专家共识的执行标准。应用串联质谱筛查IMD，其结果主要有以下影响因素。

3.1 未建立自身实验室的参考范围

每个地区的筛查实验室在筛查一定数量的标本后，应对本实验室检测的数据进行统计，建立自己的新筛参考范围，并定期进行校正[23]。串联质谱新生儿疾病筛查项目的初筛阳性率一般较高，主要原因是对某些指标的参考范围设置不合适，建立本实验室参考范围后，初筛阳性率和指标阳性率可大幅改善。

3.2 血片质量

C2、MET、ARG 这三个指标一般在温度和湿度都高的月份，阳性率会高，主要表现为低于参考值范围。如果C2 偏低会导致比值项目C3/C2 升高，如果C3/C2 升高，又会增加甲基丙二酸血症的初筛阳性率。通过对送检单位的血片质量督查，注意血片要在室内自然晾干，避免在高温、高湿环境下晾干，避免阳光、炉子、暖气等物体烘干，不得接触有机溶剂，做到无污染、无霉变，且晾干后要置于密封袋并存储于冰箱，2℃～ 8℃冰箱保存，运输过程密封低温运输，采集后5 个工作日内递送，可降低这几类指标的初筛阳性率。

3.3 实验污染或仪器污染实验污染

和仪器污染导致的指标阳性率高可以通过监測空白孔的浓度或某些指标的阳性率发现问题。比如C5DC+C6OH、C6、C8 等指标，当这类指标空白孔浓度水平和样本浓度水平升高时，可能和移液吸头质量、移液槽质量等有关，更换质量有保障的移液吸头和移液槽后该问题即可解决。仪器污染来源包括流动相污染、管路污染、进样口污染、离子源污染、三重四级杆内部污染等。其中仪器长时间未清洗维护是最常见的一种情况，可能会导致指标空白孔浓度和样本浓度水平升高，该异常情况可通过清洗三重四级杆解决。

3.4 质控异常波动

由于实验室环境变化、前处理内标工作液配制、仪器开关机后未校准等原因导致室内质控波动幅度较大时，样本的浓度水平也会随之波动，从而导致某些指标阳性率的异常波动。在室内质控异常波动时，可以通过校正RRF 值来使样本的浓度水平保持在正常水平。

3.5 摄入药物影响

新生儿代谢水平在刚出生后可能会不稳定，也会受某些药物影响。来自新生儿科等临床科室的血片，某指标阳性率会受一些药物影响，例如氨基酸水平升高可能和静滴氨基酸有关；口服左卡尼丁可导致酰基肉碱及游离肉碱C0 水平升高；头孢类药物可能会导致C5 增高[24-25]。新生儿科样本采集时，建议将母亲及新生儿的用药情况特殊标注。

4 小结

综上所述，近年来随着高效液相串联质谱技术的不断发展，越来越多的地区开展多种新生儿IMD的筛查工作，更多的IMD 种类被发现。目前我国在应用串联质谱技术筛查新生儿IMD 工作中，参考值范围差异较大，实验室需要对数据进行统计，建立自己的新筛参考范围，并定期进行校正。完善新生儿IMD 筛查工作，对IMD 进行早发现、早治疗，对于提高出生人口素质具有重要意义。