HPLC 法同时测定氯霉素醋酸曲安奈德搽剂中两组分的含量

陆 芳，王 卫

（天津市药品检验研究院，天津 300070）

氯霉素醋酸曲安奈德搽剂为《天津市医疗机构制剂规范》2016 年版收载品种，处方中含有氯霉素、醋酸曲安奈德、薄荷脑、苯酚、甘油和60%乙醇。有止痒、消炎、抗过敏、抗感染作用，用于各种皮炎、瘙痒症与虫咬症等。现行质量标准中仅以容量法对氯霉素做了含量测定控制，尚无醋酸曲安奈德的含量测定方法，为控制制剂质量，保证用药安全有效，现建立HPLC法同时测定氯霉素和醋酸曲安奈德两成分的含量。修订后的质量标准方法简便、准确、专属性及重现性好，可用于日常质量控制。

1 仪器与试药

Waters e2695 高效液相色谱仪（美国沃特斯公司），Empower 色谱工作站；XSE 205DU 电子天平（梅特勒-托利多仪器有限责任公司）。氯霉素对照品（批号130303-202115）由中国药品生物制品检定所提供，醋酸曲安奈德对照品（批号100125-202007）由中国药品生物制品检定所提供，氯霉素原料（批号009180512）由东北制药集团生产提供，醋酸曲安奈德原料（批号NTAC200501）由天津天药药业股份有限公司生产提供，氯霉素醋酸曲安奈德搽剂样品（批号20211110、20211220、20220906，规格为每1 ml 含氯霉素5 mg、醋酸曲安奈德0.25 mg）及空白辅料溶液均为天津市第一中心医院生产。甲醇为色谱纯（默克股份两合公司生产），庚烷磺酸钠为色谱纯（山东禹王实业有限公司化工分公司生产），水为去离子水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Waters Symmetry C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱；流动相A：取30 g 庚烷磺酸钠加30%甲醇溶解并稀释至1 000 ml，流动相B：甲醇，梯度洗脱（洗脱程序见表1）；检测波长为240 nm；流速：1.0 ml/min；柱温：40 ℃；进样量：20 μl。

表1 洗脱程序

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取醋酸曲安奈德对照品25 mg，置10 ml 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。精密量取1 ml，置10 ml 量瓶中，同时精密称取氯霉素对照品50 mg 加入同一量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。

2.2.2 供试品溶液的制备 取本品直接进样。

2.2.3 空白溶液的制备 按处方配比，制备不含氯霉素和醋酸曲安奈德的空白溶液。

2.3 空白干扰试验 分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液及空白溶液各20 μl，注入液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件分析，结果空白溶液在两主峰对应的保留时间处无干扰，色谱图见图1。

图1 对照品（A）供试品（B）空白（C）HPLC 色谱图

2.4 线性关系考查 精密称定氯霉素适量，加甲醇制成1、2、4、5、6 和10 mg/ml 的溶液；另精密称定醋酸曲安奈德适量，加甲醇制成0.05、0.1、0.2、0.25、0.3 和0.5 mg/ml 的溶液，按“2.1”项下色谱条件试验，记录色谱图；以浓度为横坐标（C），以相对应的峰面积为纵坐标（A），进行线性回归。 结果表明，氯霉素在0.989 5～9.895 0 mg/ml 的浓度范围内与其峰面积呈良好线性关系（r=0.999 5，n=6），其线性方程为Y=1×107X+106；醋酸曲安奈德在0.051 3～0.513 0 mg/ml 的浓度范围内与其峰面积呈良好线性关系（r=0.999 5，n=6），其线性方程为Y=4×107X -11 216。

2.5 专属性试验 分别精密量取本品和辅料各5 ml，进行专属性试验。①酸破坏：加1 mol/L 的盐酸溶液2 ml，放置30 min，用1 mol/L 氢氧化钠溶液液调至pH 为中性。②碱破坏：加1 mol/L 的氢氧化钠溶液2 ml，放置30 min，用1 mol/L 盐酸溶液液调至pH为中性。③氧化破坏：加30%过氧化氢溶液2 ml，放置30 min。④高温破坏：80 ℃加热30 min，放冷。⑤光照破坏：自然光照5 d。分别取上述5 种溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，结果表明在上述5 种苛刻试验条件下，均有不同程度的降解，但降解的杂质均能与主峰达到完全的分离，不影响主峰的测定。见图2 和图3。

图2 辅料未破坏（A）辅料酸、碱、加热破坏（B）辅料氧化破坏（C）HPLC 色谱图

2.6 精密度试验

2.6.1 系统精密度 分别选取对照品溶液和供试品溶液（1#样品），各重复进样6 次，对照品溶液峰面积RSD 为1.18%（氯霉素）和1.29%（醋酸曲安奈德），供试品溶液峰面积RSD 为0.06%（氯霉素）和0.09%（醋酸曲安奈德）。

2.6.2 方法精密度 取1 批样品（2# 样品），分别取6份供试品，按上述测定方法进样，RSD 分别为0.29%和0.20%。

2.7 稳定性试验 取对照品溶液在室温下放置48 h，照上述方法测定，结果表明对照品溶液两主峰面积相对平均偏差分别为1.6%（氯霉素）和1.5%（醋酸曲安奈德），本溶液在48 h 内稳定。

图3 样品未破坏（A）酸破坏（B）碱破坏（C）氧化破坏（D）高温破坏（E）光照破坏（F）HPLC 色谱图

2.8 回收率试验 按照处方，精密称定氯霉素原料约2.5 g，3 份，置25 ml 量瓶中，加空白辅料溶液溶解并稀释至刻度，摇匀；精密称定醋酸曲安奈德原料约0.25 g，3 份，置50 ml 量瓶中，加空白辅料溶液溶解并稀释至刻度，摇匀。分别精密量取两液各1 ml（3 份）、1 m（l3 份）、3 m（l3 份）置25 m（l3 份）、20 m（l3 份）、50 m（l3 份）量瓶中，加空白辅料溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，配制得到氯霉素和醋酸曲安奈德为80%、100%、120%的溶液9 份，按“2.1”项下色谱条件试验，记录色谱图；计算平均回收率。结果氯霉素的平均回收率为97.60%，RSD 为0.45%；醋酸曲安奈德平均回收率为101.20%，RSD 为0.59%。表明在该方法的测定条件下，氯霉素和醋酸曲安奈德回收率均良好，辅料均无干扰。见表2 和表3。

表2 氯霉素回收率试验结果

表3 醋酸曲安奈德回收率试验结果

2.9 样品含量测定 取3 批样品（批号分别为20211110、20211220、20220906），分别按照“2.1”项下方法测定，结果见表4。

2.10 粗放度试验 采用不同的仪器和改变色谱柱测定含量，进行粗放度考核，具体色谱条件如下：仪器：安捷伦1200，色谱条件同Waters e2695。色谱柱：Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），其他条件同“2.1”项下。经试验，3 批样品的含量测定结果与“2.1”项下试验方法得到的结果基本一致，见表5。

表4 3 批样品含量测定结果

表5 粗放度试验结果

3 讨论

3.1 波长的选择 分别取醋酸曲安奈德及氯霉素对照品溶液在200～400 nm 处进行紫外光谱扫描检测显示，醋酸曲安奈德在240 nm 处有最大吸收，氯霉素在240 nm 处也有吸收，但最大吸收是277 nm。处方中氯霉素是醋酸曲安奈德的20 倍，醋酸曲安奈德的量较少，故选择240 nm 波长作为检测波长。

3.2 流动相的选择 根据文献［1］采用甲醇-水（60∶40）作为流动相时，样品中苯酚色谱峰与氯霉素峰分离不完全，且出峰时间较早，不断更换流动相［2-6］探索时发现，流动相中加入0.15 mol/L 的庚烷磺酸钠时使苯酚、氯霉素和醋酸曲安奈德峰均后移，且实现了氯霉素与苯酚的分离，但醋酸曲安奈德出峰时间为60 min以后，故改为0.15 mol/L 的庚烷磺酸钠的30%甲醇和甲醇的梯度洗脱，最终实现了系统保留时间适中，色谱分离情况较好。