二代测序技术在社区获得性肺炎病原学诊断中的应用价值

胡贤珍，王亚飞，宋 成，耿 爽

1. 江汉大学医学部（武汉 430056）

2. 武汉市中心医院呼吸与危重症医学科（武汉 430014）

二代测序（next-generation sequencing，NGS）是一种新兴技术，能够同时对数十亿个核酸片段进行测序。研究表明，NGS 技术目前已被应用于多种感染性疾病的病原学诊断，如中枢神经系统、血液、呼吸道、胃肠道及眼部等的感染[1]。NGS 可以检测样本中存在的各类微生物，包括细菌、病毒、真菌、非典型病原体和寄生虫等[2-3]。传统的社区获得性肺 炎（community-acquired pneumonia，CAP） 病原体检测需要进行微生物培养、抗原/抗体免疫学检测、核酸PCR 或病毒DNA 检测等，耗时长且检测阳性率低。无法精准确定病原体可能导致抗感染药物使用不当、延误病情，或造成经验性抗感染药物广覆盖，增加抗生素滥用及病原体的耐药性[4]。通过核酸检测能够精准获得病原谱的NGS 技术可能成为CAP 患者精准治疗的有效手段，因此本研究分析NGS 病原学检测与传统病原学检测的差异，以探索NGS 在CAP 病原学检测中的应用价值。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取武汉市中心医院呼吸与危重症医学科2020 年12 月至2021 年8 月采用支气管镜检查收集肺泡灌洗液标本并行NGS 送检的64 例CAP 患者作为研究对象。纳入标准：①符合《中国成人社区获得性肺炎诊断和治疗指南（2016 年版）》中的社区获得性肺炎诊断标准[5]；②患者均进行了NGS 送检以及传统病原学检测。排除标准：①无法耐受支气管镜下肺泡灌洗操作的患者；②重复送检患者。本研究经武汉市中心医院伦理委员会伦理审查通过（院-自-伦函2021（6））。

1.2 研究方法

回顾性分析纳入64 例研究对象的临床相关资料，收集肺泡灌洗液NGS 病原学检查结果以及同期送检的传统病原学结果，包括肺泡灌洗液及细菌培养、真菌培养、各类病毒核酸及抗体检测、肺炎支原体及肺炎衣原体IgG、IgM 检测结果等。

1.3 统计分析

使用SPSS 25.0 对数据进行统计分析，计数资料采用频数和百分比（n，%）进行描述，采用χ2检验比较NGS 与传统病原学检测方法间的差异。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

研究共纳入64 例CAP 患者，其中男性39 例、女性25 例，年龄21～90 岁、平均年龄（63.55±16.39）岁。NGS 检测阳性55 例、阴性9 例。NGS 阳性患者中，41 例检出细菌、27 例检出真菌、29 例检出病毒、2 例检出鹦鹉热衣原体、6 例检出结核分枝杆菌、1 例检出嗜肺军团菌。传统病原学检测中，17 例检出细菌、31 例检出真菌、2 例检出病毒、2 例检出肺炎衣原体、4 例检出结核分枝杆菌。

2.2 NGS与传统细菌培养检测结果比较

NGS 中41 例检出细菌，传统细菌培养17 例检出细菌，NGS 细菌检出率显著高于传统细菌培养检测（64.1% vs. 26.6%，P＜0.001）（表1）。肺泡灌洗液NGS 检出细菌27 种，其中铜绿假单胞菌（8 株）、卡他莫拉菌（6 株）、结核分枝杆菌复合群（6 株）检出株数较多；传统细菌培养出细菌6 种，其中检出菌株较多的是铜绿假单胞菌（8 株）和肺炎克雷伯菌（6 株），详情见表2。

表1 NGS与传统细菌培养的细菌检测结果比较Table 1. Comparison of bacterial detection results between NGS and traditional bacterial culture

表2 NGS与传统细菌培养的细菌检测情况Table 2. Bacterial detection by NGS versus conventional bacterial culture

2.3 NGS与传统真菌培养检测结果比较

NGS 有27 例患者检出真菌，传统真菌培养有31 例检出真菌，NGS 检出率与传统真菌培养检测之间无显著差异（42.2% vs. 48.4%，P=0.48），见表3。NGS 检出真菌12 种，其中白色念珠菌检出株数最多（16 株）；传统真菌培养培养出真菌7 种，检出数最多的亦为白色念珠菌（21 株），见表4。

表3 NGS与传统真菌培养真菌检测结果比较Table 3. Comparison of fungal detection results between NGS and traditional fungal culture

表4 NGS与传统真菌培养的真菌检测情况Table 4. Fungal detection by NGS versus conventional fungal culture

2.4 NGS与传统病原学检测其他病原体的比较

NGS 共检出29 例病毒阳性，包括人类疱疹病毒1 型（11 例）、人类疱疹病毒4 型（8 例）、人类疱疹病毒5 型（4 例）、人类疱疹病毒7 型（2 例）、人类疱疹病毒6B 型（1 例）、细环病毒（3 例）；而传统病毒检验技术仅检出2例EB病毒DNA阳性。

NGS 送检患者中检出1 例嗜肺军团菌感染，传统方法则未检出。NGS 送检患者中检出6 例结核分枝杆菌感染，另有2 例鹦鹉热衣原体感染，结合临床可确定为衣原体感染肺炎。采用传统肺炎支原体衣原体抗体检测技术，5 例肺炎衣原体IgM 抗体阳性、56 例肺炎衣原体IgG 抗体阳性、无肺炎支原体IgM 阳性、6 例肺炎支原体IgG 抗体阳性。

3 讨论

对于CAP 患者，采用恰当的检测手段尽早明确其病原学诊断具有重要的临床意义。一方面可以缩短患者住院时间，另一方面能够有效避免抗生素滥用。传统病原学检测技术成熟、应用广泛，然而面临着病原谱窄、检测阳性率低、精确度低、检测周期长等局限，易致疾病治疗延误及抗菌药物滥用[6]。近年来，NGS 为下呼吸道感染的病原学诊断提供了更有效、准确的手段[4]。该方法允许通用病原体检测，而不考虑微生物（病毒、细菌、真菌和寄生虫）的类型[7]。不需要做出临床假设，检测范围广泛，避免了传统病原学检测易导致的漏检。NGS 还可以检出一些传统检验方法无法检出的特定病原体，从而提高病原体检出率[8]。在诊断时间上，NGS 技术与传统检验方法相比有明显优势，NGS 技术所需时间在24 h 内，而传统细菌培养时间为 2～5 d[9]。

研究结果显示，NGS 检测阳性率高于传统细菌培养，此外，通过NGS 可以同时检测出更多病原体种类，有助于临床针对性治疗。两者结果差异考虑可能与未及时接种导致病原体死亡、细菌生长被优势真菌掩盖，以及抗菌药物使用、细菌本身培养条件苛刻有关。使用NGS 技术进行CAP患者的病原学检测，无需依赖培养方式来检测和鉴定病原微生物，特别是对于一些难以培养的微生物，NGS 可以缩短检测所需时间，从而尽早明确病原种类并进行针对性治疗。林定文等在关于肺结核病原诊断技术的进展中指出，通过二代测序新型全基因组测序技术，能够提高病原识别能力，操作难度小且能够降低试验成本，以后将成为结核病原诊断的重要手段[10]。

在真菌检测方面，NGS 与传统真菌培养没有明显差异。原因可能与真菌细胞壁厚，难以裂解，NGS 存在一定的假阴性有关[11]。但是，传统真菌培养检出真菌种类明显少于NGS，结果显示真菌培养对念珠菌属更敏感，对曲霉菌属及孢子菌属不敏感。韩李周等对NGS 在侵袭性肺真菌病的研究中也表明，传统检测对念珠菌最敏感，曲霉菌次之，而NGS 对二者均较敏感[12]。相较于传统病原学检测手段，NGS 能够检测出更多种类的真菌。

在病毒检测方面，NGS 不依赖于临床假设，能够直接提取样本病毒核酸进行检测，且能同时检测出多种病毒，相较于传统病原学检测更快捷，检测范围更广，且能够检出临床不常见的病原体。张绵等的研究表明在重症患者中应用宏基因组二代测序技术，能够提高病原菌检出的阳性率，尤其是病毒和真菌，从而更好、更及时地指导患者的治疗，且对预后有一定改善作用[9]。但NGS 检出病毒，如细环病毒、HSV1 型等病毒，可能存在定植、污染等，并不意味着患者感染相应病毒性肺炎，需将患者的临床资料与NGS 结果结合分析。

在非典型病原体检测方面，NGS 检测出了传统检测中未检出的嗜肺军团菌及鹦鹉热衣原体。在结核检测方面，NGS 比结核感染T 细胞检测阳性率更高。代小伟等比较了NGS 与涂片、培养和xpert 对结核分枝杆菌的诊断效能，显示NGS 技术检测的敏感度最高，与临床诊断的一致性也最高，能够快速、高效检测痰标本中的结核分枝杆菌，可早期辅助诊断疑似肺结核患者[13]。在该研究中，NGS 与传统病原学检测方法在肺炎支原体检测中目前均无阳性，与临床诊断结果一致。而在肺炎衣原体的检测中，NGS 未检出传统病原学检测方法检出的肺炎衣原体。国内外缺少NGS 与肺炎衣原体血清学检测在肺炎衣原体检出中的阳性率对比。NGS 在支原体及衣原体检测中是否优于传统病原学检测还需要更多的研究进一步验证。

综上所述，NGS能够同时检测患者细菌、真菌、病毒和其他非典型病原微生物。相较于传统病原学检测方法，NGS 检测病原微生物范围广泛，种类丰富，在社区获得性肺炎患者的病原学诊断中具有重要意义，但仍需结合临床进一步分析明确。