低温等离子体在不同时间条件下对黄曲霉孢子灭活作用的研究

郁明明,谢岩黎

河南工业大学 粮油食品学院, 河南 郑州 450001

食品在食物链的各个阶段都可能受到黄曲霉的污染,例如收获后、加工过程或储存期间[1]。据联合国粮食及农业组织报道,全世界大约有25%的谷物受到黄曲霉菌及其毒素污染,尤其玉米和花生最易受到侵染,从而导致巨大的经济损失,其中美国每年因为真菌毒素污染造成的损失约10亿美元[2]。而我国又是粮食大国,随着粮食作物贸易出口的发展,在采收、储藏和运输过程中因黄曲霉污染造成的损失及危害越来越大。黄曲霉是散装储存原料(如小麦、玉米和豆类)和最终产品变质的主要原因[3]。除腐败等食品质量问题外,黄曲霉菌还存在食品安全问题,黄曲霉毒素是黄曲霉菌产生的代谢中间产物,对人和动物具有毒性作用[4]。即使在低剂量下摄入,也会产生对人体有毒、致癌和致突变的黄曲霉毒素[5]。因此为了避免粮食中黄曲霉污染导致的经济损失和健康危害,亟须寻找安全有效的方法控制黄曲霉侵染。

等离子体被称为物质的第4种状态,是一种电离气体,呈准中性。低温等离子体源的本质是向不同中性气体施加电场从而产生活性粒子以满足预期应用[6]。低温等离子体在形成过程中会发生许多物理和化学反应,因此含有多种不同的活性成分,如带电粒子(电子、正负离子等)、紫外线(UV)、化学活性粒子(ROS和RON等)、激发态粒子和亚稳态粒子等[7]。这些活性组分可以从细胞分子水平上对生物结构造成影响[8]。目前的灭菌净化方法包括辐射、微波、光调控抑菌等物理方法[9],合成化学防霉剂如苯甲酸、山梨酸等化学方法[10],拮抗菌及其代谢产物的筛选等生物方法[11]。但这些处理方法存在各种各样的问题：物理方法大部分都会改变食物基质(如颜色、质地、风味)和营养含量;化学防霉剂容易在食品中残留,危害身体健康;生物方法目前仅限于实验室使用,应用度不高且价格昂贵[12]。低温等离子体不仅对生物污染有很大影响,而且对食品基质进行有限的改性,极大保留了食品功能性。该方式之前已被证明可有效降低食品中7种常见食源性细菌的细菌负荷,并降解残余真菌毒素,包括极难降解的脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)[13]。

低温等离子体因其独特的优点引起越来越多的研究人员关注,其具有杀灭各种微生物的能力,包括细菌、细菌芽孢、生物膜、酵母、真菌孢子、真菌菌丝及病毒等。迄今为止,关于低温等离子体杀菌的报道众多,但因等离子体的成分和生物响应的复杂性,其对黄曲霉菌的杀灭机制尚未彻底解析。

由于食品加工对灭菌技术是否影响食品感官指标和营养成分具有严格的要求,一般要求灭菌在常温、常压下进行,这样才有工业化的价值。低温等离子体作为一种新型的食品加工处理方法,在提高产品安全性、延长食品保质期方面具有广阔的应用前景[14]。作者选取黄曲霉孢子为对象,探讨低温等离子体对黄曲霉杀菌效果,为后续研究等离子体对黄曲霉菌的灭活机制夯实基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黄曲霉菌株(CGMCC 3.6304)：中国通用微生物培养收集中心(CGMCC);葡萄糖、琼脂粉、戊二醛：天津市科密欧化学试剂有限公司;蛋白胨：北京奥博星生物技术有限责任公司;无水乙醇、氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、叔丁醇：天津市天力化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

CTP-2000K等离子体实验电源、DBD-50低温等离子体空气常压实验反应器：南京苏曼等离子体科技有限公司;电子分析天平：梅特勒-托利多仪器有限公司;PYX-DHS-40XS0-BS恒温恒湿培养箱：上海跃进医疗器械厂;LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂;BM-37XBC倒置生物显微镜：上海彼爱姆光学仪器制造有限公司;SW-CJ-2D单人双面净化工作台：苏州净化设备有限公司;FB-20pH计：奥豪斯仪器(常州)有限公司;Quanta 250FEG扫描电子显微镜：美国FEI公司;UV-6100S紫外-可见分光光度计：上海美谱达仪器有限公司;F-7100荧光分光光度计：日立高新技术公司;DFC7000Y荧光显微镜：德国徕卡;TGL-16M台式高速冷冻离心机：湘仪离心机仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌种活化及孢子悬浮液的制备

将黄曲霉菌接种于葡萄糖琼脂(SDA：4%葡萄糖、1%蛋白胨和2%琼脂),放于恒温培养箱,(28±2 )℃培养6 d[15]。孢子用0.9%生理盐水浸入6 d龄培养物的表面来收集悬浮液,用无菌的L形撒布器轻轻地刮,将供试菌株的孢子悬浮液用无菌擦镜纸过滤,用生理盐水洗脱并过滤菌丝得到孢子悬浮液。然后,采用血球计数板计数黄曲霉孢子,将孢子悬浮液浓度稀释至106个/mL。2 000g离心5 min洗涤收集孢子。

孢子悬浮液的制备：在直径为5 cm的无菌石英皿中,加入2 mL真菌孢子液(1×106个/mL),分别经工作电压70 kV等离子体处理0(对照)、30、60、90 s。孢子悬浮液表面距离电介质表面约5 mm。随后将处理的菌液收集于无菌离心管中备用。

1.3.2 等离子体处理对黄曲霉孢子萌发影响的测定

取 150 μL 现配的黄曲霉孢子悬浮液(5×105个/mL),等离子体处理0、30、60、90 s后置于 96 孔板中,加入50 μL沙式葡萄糖液体培养基以提供萌发所需要的营养物质,将处理好的 96 孔板于恒温恒湿培养箱中,(28±2) ℃条件下静置培养 48 h后,使用倒置显微镜每 24 h观察孢子的生长情况并拍照,并用酶标仪检测 620 nm处吸光度。72 h后仍没有孢子萌发的处理组即为抑制黄曲霉孢子生长的处理组[16]。

1.3.3 等离子体处理对黄曲霉孢子形态结构观察

参考Shen等[17]的方法。将1.3.1中经低温等离子体处理的菌液2 000g离心 5 min 去除上清液,用PBS 缓冲液(pH 7.4)洗涤孢子,2.5%的预冷戊二醛4 ℃ 固定过夜。PBS 洗涤孢子,用30%～100%的乙醇梯度洗脱,脱去孢子水分,再用叔丁醇洗涤,脱去乙醇,最后用叔丁醇重悬孢子,冷冻干燥。以未经等离子体处理的黄曲霉孢子悬浮液为对照组。将等离子体处理后的孢子喷金,扫描电镜观察。

1.3.4 内容物含量的测定

参考周海恩[18]的方法。取 200 μL(5×105个/mL)新鲜配制的黄曲霉孢子悬浮液,等离子体处理30、60、90 s后置于含有 10 mL SDB的50 mL三角瓶中。将三角瓶置于培养箱((28±2) ℃)静置培养,24 h后取 2 mL,8 000g离心10 min,取上清液于260 nm处测定吸光度并用SDB校准空白。

1.3.5 相对电导率和 pH 值的测定

参考Li等[19]的方法,取2 mL现配的黄曲霉孢子悬浮液,2 000g离心5 min,使用生理盐水洗涤3次,去除杂质以减少试验误差。等离子体处理30、60、90 s后,将黄曲霉孢子置于培养箱((28±2) ℃)静置培养4 h,设置3个平行,每过1 h依次测定处理时间0、30、60、90 s的胞外电导率和 pH 值。

1.3.6 胞内活性氧检测

参考Li等[20]的方法,利用活性氧检测试剂盒(CA1410,Solarbio,China)所提供的荧光探针2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)检测经等离子体处理的黄曲霉菌胞内活性氧(ROS),将1.3.1中的细胞悬液收集到1.5 mL离心管中,2 000g离心5 min,收集细胞沉淀,用0.01 mol/L PBS洗涤2次,2 000g离心5 min,吸净上清液,留细胞沉淀用于测定。用0.01 mol/L PBS稀释DCFH-DA探针使其终浓度为10 μmol/L,用1 mL稀释好的探针重悬上述细胞沉淀,制成细胞悬液,于恒温恒湿培养箱(37±2) ℃孵育细胞30 min,每隔5 min颠倒混匀使探针与细胞充分接触。收集孵育(探针标记)后的单细胞悬液,2 000g离心5 min,吸净上清液,用PBS洗涤2次以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA,离心收集细胞沉淀用于荧光检测,用荧光显微镜观察并拍照。使用Image J计算ROS的荧光强度。

1.4 数据分析

利用SPSS 22软件进行单因素方差分析(P<0.05),并采用Origin Pro 2021软件绘制图表。

2 结果与分析

2.1 等离子体处理对黄曲霉菌孢子萌发的影响

从图 1可以看到,未经任何处理的黄曲霉孢子在 48 h后全部萌发,30、60、90 s等离子体处理组在 24、48 h后,孢子均没有萌发。通过620 nm处吸光度监测真菌的生长状况,主要是通过培养液的浊度来反映真菌数。由图2可知,空白对照组的吸光度在72 h内处逐渐升高,30、60、90 s处理组与对照组相比,620 nm处吸光度有显著性变化(P<0.05),显微镜观察仍是孢子。所以,认为介质阻挡放电低温等离子体装置在功率70 kV下,与对照组相比,可延缓黄曲霉孢子萌发,随着处理时间延长,在30、60、90 s可以完全抑制黄曲霉孢子萌发。同时发现处理组均出现细胞聚集现象,且处理时间越长,细胞聚集现象越明显(图1)。推测黄曲霉孢子损伤产生氧化应激并修复受损孢子,即真菌进行等离子处理后的基因表达调控行为。这一发现对后续研究等离子体对黄曲霉菌的灭活机制提供了思路。

图1 显微镜下黄曲霉孢子的萌发情况Fig.1 Germination of A. flavus spores under microscope

注：不同的小写字母表示差异显著(P<0.05)。图4、图6、图7同。图2 黄曲霉孢子在620 nm处的吸光度Fig.2 Absorbance value of A. flavus spores at a wavelength of 620 nm

2.2 等离子体处理对黄曲霉孢子形态结构的影响

由图3可知,对照组的孢子形态饱满、圆润、排列整齐。介质阻挡放电等离子体装置在功率70 kV下,当处理时间30、60 s时黄曲霉孢子表面形态结构与对照组相比发生轻微变化,孢子出现不规则收缩,表面褶皱、变形。然而当处理时间增加至90 s时,与对照组相比黄曲霉孢子形态发生明显变化,出现凹陷、皱缩等现象,且细胞表面趋于光滑,膜蛋白数量减少。这些结果表明,等离子体处理确实改变了黄曲霉孢子的形态,并且这种作用是剂量依赖性的,是随处理时间延长的。所以研究等离子体对黄曲霉菌细胞膜的影响对探讨其抗真菌机制具有重要意义。

2.3 等离子体对黄曲霉菌内容物含量的影响

核酸在波长 260 nm 处有吸收峰,因此通过测量 260 nm 的吸光度以评估细胞成分的释放。等离子体处理后黄曲霉孢子核酸泄露的结果如图 4 所示。与对照组相比,随着处理时间的延长,吸光度逐渐升高,细胞成分的释放逐渐增加。其中,30 s处理组在260 nm处的吸光度(0.344)与对照组(0.270)有显著性变化(P<0.05),黄曲霉孢子内容物发生外渗。30 s和60 s

图3 黄曲霉孢子表面形态结构Fig.3 A. flavus spore surface morphology

图4 黄曲霉孢子核酸泄露的结果Fig.4 Result of nucleic acid leakage from A.flavus spores

处理组(0.381)没有显著性变化,变化趋势较为平缓,黄曲霉孢子内容物泄露量小幅度增加,而90 s处理组(0.510)的效果有最明显上升趋势,约为对照组的1.89倍,黄曲霉孢子内容物的泄漏量大幅增加。结果表明,黄曲霉菌经等离子体作用后,黄曲霉孢子细胞膜破损,从而导致细胞内容物渗出。

2.4 等离子体对黄曲霉菌细胞膜通透性的影响

图5 黄曲霉孢子胞外电导率Fig.5 Extracellular conductivity of A. flavus

细胞膜通透性对维持细胞的微环境和正常代谢起着重要的作用,经等离子体处理后黄曲霉孢子胞外电导率的结果如图 5所示。与对照组相比,处理后的黄曲霉孢子胞外电导率均呈现上升趋势,且随着处理时间的延长,电导率上升情况明显升高。继续培养发现电导率出现有规律的浮动情况,在培养的第1个小时内电导率均有上升趋势,推测此时黄曲霉孢子细胞膜遭到破坏,细胞膜通透性增强,大量电解质外渗,导致电导率小幅上升。继续培养并检测发现胞外电导率逐渐下降并趋于稳定,说明此时离子运输情况逐渐顺畅,细胞膜通透性趋于稳定。

为了进一步明确胞外电解质渗透的酸碱性质,测定了细胞外pH值。由图6可知,从总体上看,经等离子体处理的黄曲霉孢子pH值呈酸性,且在4 h之内对照组和处理组的pH值分别稳定在最高和最低。对照组在4 h之内pH值轻微下降,这可能与细胞和纯化水之间的渗透压差异有关。4 h时,0、30、60、90 s组pH值依次为5.88±0.07、1.88±0.05、1.52±0.05、1.31±0.02(P<0.05)。因此,等离子体可以显著诱导细胞组分泄露,而这些组分整体酸性较强。总之,等离子体破坏了黄曲霉菌细胞膜,改变了细胞膜的通透性。

图6 黄曲霉孢子细胞外pH值Fig.6 Extracellular pH value of A. flavus spores

2.5 等离子体对黄曲霉菌活性氧(ROS)的影响

脂质是真菌细胞膜的主要成分,黄曲霉孢子细胞膜遭到破坏,等离子体可能诱导了黄曲霉菌脂质过氧化,导致更多过氧化产物的生成,所以需要检测ROS含量。ROS是氧代谢产生的具有高化学反应性的关键物质,如超氧自由基(·O2-)、H2O2和羟基自由基(·OH)[21]。在诱导脂质、蛋白质、DNA和其他大分子的氧化损伤方面,ROS发挥着重要作用[22]。不同处理时间对黄曲霉孢子细胞内ROS荧光强度的影响如图7所示。30 s处理组的荧光强度与对照组间有显著性差异,30 s与60 s处理组的荧光强度没有显著性差异,与90 s处理组相比有显著性差异。30、60、90 s处理组ROS荧光强度分别是对照组的2.01倍、2.19倍、3.89倍。因此,等离子体被证实诱导了黄曲霉孢子的氧化损伤,造成了黄曲霉中ROS的积累。

图7 胞内荧光强度Fig.7 Intracellular fluorescence intensity

3 结论

利用介质阻挡放电低温等离子体装置,在不同时间处理条件下对黄曲霉孢子的影响进行研究。分析了等离子体对黄曲霉孢子的抑制效果,处理组与对照组相比,介质阻挡放电低温等离子体在工作条件为电压70 kV,距离电介质表面约5 mm时,仅需30～90 s处理即可抑制黄曲霉孢子萌发并使其灭活,SEM结果表明,等离子体处理后,黄曲霉孢子状态明显改变,出现变形和皱缩。为了进一步研究等离子体对黄曲霉细胞膜通透性的影响,检测出黄曲霉菌处理组的内容物发生泄露,而且通过检测处理前后的细胞微环境变化进一步说明等离子体破坏了细胞膜,改变了细胞膜通透性。通过荧光分析,说明经等离子体处理后,黄曲霉孢子遭受了氧化损伤,证实了等离子体诱导黄曲霉菌中ROS的积累,对后续等离子体对黄曲霉菌灭活效果的机制研究具有重要意义。