雌性大鼠和雄性大鼠高尿酸血症动物模型的动态比较

阿依努·艾力 布威阿依谢姆·努尔麦麦提 阿迪拉·阿扎提 迪丽达尔·希力甫

(1.新疆医科大学第一临床学院,新疆 乌鲁木齐 830011;2.新疆医科大学第一附属医院心脏中心,新疆 乌鲁木齐 830011)

近年来,随着生活水平的改善、饮食结构及生活环境的改变,高尿酸血症(hyperuricemia,HUA)的患病率也逐年上升,目前中国估计有超过1.8亿人患HUA[1],患病率约为13.3%[2]。HUA是导致痛风、高血压、高血脂和糖尿病等代谢综合征的主要原因之一,须及早进行干预。经典的降尿酸药物多存在疗效不显著、不良反应明显、患者耐受性差的问题,因此开发新型的安全有效的降尿酸药物成为目前社会持续关注的重要课题。而合适的动物模型是开展药物活性研究的基础,故建立与人体尿酸(uric acid,UA)代谢更相似、更接近人类发病机制的HUA动物模型对于研究寻找治疗HUA药物具有重要意义。

国内外报道关于HUA动物模型的制备:Dhouibi等[3]用腹腔注射氧嗪酸钾成功诱导出稳定持久大鼠HUA模型,陈光亮等[4]采用酵母膏灌胃成功复制出小鼠HUA模型。但采用药物单独构建模型的方法因其作用机制单一,往往不能达到预期理想状态,故将多种不同机制的方法同时使用造模,可起到升高尿酸的协同作用。笔者在前期实验[5]中也选择酵母膏喂养联合200 mg/kg氧嗪酸钾腹腔注射制备大鼠HUA模型,该模型不仅具有血清UA水平升高迅速、维持时间长、肾功能损伤程度较轻,还可引起心脏、肾脏、大小动脉等组织器官的继发性病理改变,为HUA的药物治疗提供了较理想的动物模型配伍剂量,因此本研究继续使用该配伍剂量造模。HUA在男性通常定义为UA>416.5 μmol/L,在女性定义为UA>357 μmol/L,可见性别差异可能影响HUA的发展过程[6]。常采用雄性动物作为HUA动物模型,很少采用雌性动物,故本研究将分别选取雌性和雄性大鼠建立HUA模型,通过UA、血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、血肌酐(creatinine,Cr)水平及心脏、肾脏、腹主动脉及尾动脉病理改变等指标动态比较雌性和雄性大鼠HUA的造模效果。

1 材料与方法

设计:随机对照试验。时间及地点:2020年4月29日—2020年5月28日,新疆医科大学第一附属医院动物实验中心。

1.1 材料

1.1.1 实验动物

分别选取健康雌性和雄性大鼠各20只[7],体重(203.80±32.15)g,由新疆医科大学第一附属医院动物实验中心提供,所有动物喂养1周后实验,每周称体重2次,根据体重调整给药剂量。

1.1.2 试剂与仪器

酵母膏由北京奥博星生物技术有限责任公司生产,氧嗪酸钾由德国Aldrich Chemical公司生产。UA、Cr、BUN检测试剂盒由美国贝克曼库尔特有限责任公司生产。

1.2 试验方法

1.2.1 实验分组

将40只大鼠用随机抽样法分为四组:C1组,雄性对照组;C2组,雌性对照组;M1组,雄性模型组;M2组,雌性模型组。每组10只,给予M1组和M2组酵母膏每只21 g/(kg·d)喂养联合氧嗪酸钾200 mg/(kg·d)持续腹腔注射,每日给药1次,每3 d称重1次,持续28 d,自由饮水。C1组和C2组普通饲料喂养,自由饮水。

1.2.2 标本收集

(1)血清指标的测定:在试验第0、7、14、21、28天,以1%苯巴比妥腹腔注射麻醉大鼠,于内眦取血2 mL,室温静置10 min后离心分离(4 000 r/min,10 min,4 ℃),用美国贝克曼库尔特有限责任公司生产的试剂盒(批号442785)检测UA、Cr和BUN水平。(2)第28天以1%苯巴比妥腹腔注射麻醉大鼠,开腹取出心脏、右侧肾脏、腹主动脉和尾动脉中段,石蜡切片脱蜡至水,放入苏木素染液中染色7 min,蒸馏水冲洗1 min,盐酸乙醇分色20 s,蒸馏水冲洗1 min,淡氨水返蓝10 s,蒸馏水冲洗,将切片放入伊红染液中染色5 min,蒸馏水冲洗1 min,梯度酒精脱水,透明,封片,显微镜下观察染色情况。

1.3 统计学分析

采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析,计量资料采用均数±标准差表示,采用重复测量方差分析进行各个指标分析,组间两两比较采用LSD法,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 试验动物数量分析

试验共纳入40只大鼠,均进入结果分析,无脱失。

2.2 各组血清UA、BUN和Cr水平等相关指标的变化

2.2.1 大鼠UA数据结果分析

重复测量设计方差分析结果显示:干预模型可使M1组和M2组随给药时间的延长而升高UA值(P<0.05),且M2组UA值高于M1组(P<0.05),见表1和图1。

图1 四组研究对象UA值比较

表1 四组研究对象UA值比较 单位: μmol/L

2.2.2 大鼠Cr数据结果分析

重复测量设计方差分析结果显示:干预模型可使M1组和M2组在第14天Cr值增加至最高水平(P<0.05),至第21天时差异无统计学意义(P>0.05),至第28天时Cr值有下降(P<0.05),但仍高于对照组(P<0.05),见表2和图2。

图2 四组研究对象Cr值比较

表2 四组研究对象Cr值比较 单位: μmol/L

2.2.3 大鼠BUN数据分析结果

重复测量设计方差分析结果显示:M1组和M2组在观察的第7、14、21、28天内BUN与第0天比较,差异均有统计学意义(P<0.05),提示M1组和M2组的BUN值在7 d内开始有变化;干预模型可使M1组和M2组在第7天达到最高水平(P<0.05);至第14天时BUN值有下降(P<0.05),M2组BUN值高于M1组(P<0.05),见表3和图3。

表3 四组研究对象BUN值比较 单位: μmol/L

图3 四组研究对象BUN值比较

2.3 大鼠组织器官病理切片变化

2.3.1 大鼠心脏组织病理改变

心脏病理检查结果:M1组和M2组肌间质都可偶见淋巴细胞及浆细胞等炎性细胞的浸润,此外M1组心肌细胞未见明显水肿或增殖,M2组可见部分心肌和胞浆溶解,其周边心肌组织代偿性增生,肌间质可见巨噬细胞增生反应,部分血管内皮细胞增殖,肌间质血管不同程度扩张伴有淤血和出血。与空白对照组相比有明显差异,见图4。

注:HE染色(放大,4×100)。图4 实验终点日四组大鼠心脏组织病理切片

2.3.2 大鼠肾脏组织病理改变

肾脏病理检查结果:M1组肾组织形态结构发生轻微的病理改变,包括肾小球囊壁增厚、肾小管上皮细胞水肿、肾间质出现少许慢性炎性细胞浸润;M2组除了上述病变可见肾小球毛细血管袢内少许内皮细胞增殖伴出血、炎性细胞浸润、肾小管上皮细胞水肿等,肾间质出现少许慢性炎性细胞浸润,见图5。

注:HE染色(放大,4×100)。图5 实验终点日四组大鼠肾脏组织病理切片

2.3.3 大鼠腹主动脉病理改变

腹主动脉病理检查结果:M1组可见动脉内皮细胞脱落,血管中膜平滑肌细胞增殖;M2组还可见中膜脱落,有纤维结缔组织填充,外膜纤维结缔组织增生,见图6。

2.3.4 大鼠尾动脉病理改变

尾动脉病理检查结果:M1组可见内皮细胞显著增殖、管腔狭窄;M2组除了上述病变还可见中膜纤维组织增生,平滑肌细胞脱落,见图7。

注:HE染色(放大,4×100)。图7 实验终点日四组大鼠尾动脉病理切片

3 讨论

UA是由嘌呤和含嘌呤的化合物分解生成的嘌呤降解产物[8]。人类缺乏尿酸酶,而尿酸酶是代谢UA转化为水溶性尿囊素的三种酶序列中的第一种,人类在进化过程中,水溶性尿囊素的三种酶所对应的基因启动子区域及蛋白质编码序列的多个独立突变导致了基因沉默[9-10],因此体内的UA无法分解成可溶性的尿囊素随尿液排出。人体内UA有20%来源于食物,80%为体内自行合成[11]。生成的UA约70%经过肾脏排泄,30%经过胃肠道排泄[12]。当UA的生成和排泄的平衡被打破,会引起体内UA水平异常,从而导致HUA。

HUA造模途径有增加UA来源、抑制UA排出与抑制尿酸酶的活性[13-15]。HUA诱发的疾病多见于男性,常见相关研究的动物选择中,雄性较雌性多见。而HUA高发人群主要为中老年男性及绝经后的女性,目前正逐渐向年轻群体扩散[16],故本研究分别备制雌性和雄性大鼠HUA模型进行造模效果比较。酵母膏是高嘌呤类食物,氧嗪酸钾是尿酸酶抑制剂[17],当给予氧嗪酸钾后,由于药物的竞争性抑制机制,尿酸酶的活性受到抑制,从而减少UA分解,间接升高血清中UA水平[18]。有文献[19-20]报道,UA、BUN和Cr水平是判断HUA动物模型构建成功与否的金指标。本研究通过观察雌性和雄性大鼠体重、血清中的UA、BUN和Cr等指标判断造模效果。实验数据分析得知雌性和雄性大鼠血UA水平均升高,第7天M1组和M2组与C1组和C2组比较UA明显升高(P<0.05),且M2组高于M1组;第21天,M1组和M2组与C1组和C2组相比,UA均显著升高。BUN与UA有一定同步化趋势。所得数据提示:为期28 d联合药物造模可建立持久和稳定的HUA动物模型,且M2组优于M1组。也有文献报道和临床证据[21-22]显示,UA与Cr、BUN并无明显相关性,临床上有大量HUA患者,其Cr和BUN与正常人相当,只有当肾小球滤过功能下降到正常水平的1/3时,Cr及BUN才会明显上升,因此无法仅通过Cr及BUN结果判断大鼠肾脏损伤程度,须结合病理切片结果分析。故本研究在实验第28天处死所有动物,对雌性和雄性大鼠肾脏、心脏、腹主动脉及尾动脉进行形态学对比观察。

UA在人体内以钠盐的形式存在,当体内UA浓度超过其在体液中饱和浓度时,易在组织中析出单钠尿酸盐晶体[23],单钠尿酸盐在体内可引起炎症反应[24],导致肾小球和肾小管细胞损伤,最终导致肾纤维化[25],随着血UA的升高还可引起冠状动脉粥样硬化性改变[26]。本研究中对照组的各组织器官病理组织形态学均正常,肾脏病理切片提示M2组可见较M1组明显的肾小球毛细血管袢内少许内皮细胞增殖伴出血和炎性细胞浸润、肾小管上皮细胞水肿等,肾间质出现少许慢性炎性细胞浸润;心脏病理切片提示M2组可见较M1组明显的心肌和胞浆溶解,其周边心肌组织代偿性增生;腹主动脉病理切片M2组可见较M1组明显的中膜脱落,有纤维结缔组织填充,外膜纤维结缔组织增生;尾动脉病理切片提示M2组可见较M1组明显的管腔狭窄、中膜纤维组织增生、平滑肌细胞脱落。

通过对雌性和雄性大鼠生化指标及组织器官病理改变的动态比较可知,同等剂量的酵母膏联合氧嗪酸钾喂养制备雌性和雄性HUA动物模型,UA、BUN和Cr稳定且持续地维持在高水平,高UA水平下肾脏、心脏、腹主动脉及尾动脉也出现相应的病理改变,且雌性大鼠模型组造模效果优于雄性大鼠模型组造模效果。该研究实验结果提示,联合造模法可建立不同性别UA升高引发心肾血管病理改变的大鼠模型,可用于治疗不同性别HUA所致肾损伤及心血管疾病的药物评价,并且雌性大鼠模型可能为研究HUA的发病机制、药物选择及治疗等提供更理想的动物模型选择对象。