GPR120和GPR40表达与卵巢癌临床病理特征及预后的关系

李娟，倪惠华

卵巢癌是目前仅次于宫颈癌的第二大常见妇科恶性肿瘤，2020 年全球约有31 万卵巢癌新发病例［1］。由于早期症状不明显，多数患者在诊断时已为晚期，总体预后较差［2-3］。卵巢癌不同的表观遗传学特征与分子异质性有关，迫切需要探索更多分子标志物用于早期诊断与患者风险分层，以优化个性化治疗策略［4］。游离脂肪酸具有受体信号，在基因表达和能量稳态调节等方面发挥关键作用［5-6］。研究发现，游离脂肪酸与G 蛋白偶联跨膜受体家族中的游离脂肪酸受体（FFAR）结合而充当细胞外信号分子。G 蛋白偶联受体（GPR）120 和GPR40 可被中长链游离脂肪酸激活在调节血脂和葡萄糖代谢以及炎症反应中发挥重要作用［7］。目前，已有多项研究报道，GPR120 与GPR40 在多种人类癌症组织和细胞系中存在异常表达［8-10］，提示这些游离脂肪酸受体可能参与了肿瘤的发生发展过程。然而，少有关于GPR120与GPR40在卵巢癌中作用的报道。体内动物模型与体外细胞研究显示，卵巢细胞可表达GPR120 与GPR40，而抑制两者表达可影响细胞生长［11-12］。因此，本研究通过免疫组织化学染色分析GPR120 与GPR40 在卵巢癌样本中的表达情况，探讨2种蛋白表达与卵巢癌患者临床病理特征及预后的关系，旨在阐明GPR120 与GPR40 作为卵巢癌分子标志物的临床意义。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2017年1月—2019年12月在南通大学附属医院妇产科受手术治疗的128例原发性卵巢癌患者，平均年龄（54.8±12.2）岁。纳入标准：（1）经术后组织病理学明确诊断为上皮性来源卵巢癌，包括浆液性和黏液性。（2）FIGO分期Ⅰ—Ⅲ期，无超出腹腔的远处转移。排除标准：（1）术前接受化疗、放疗等的抗肿瘤治疗者。（2）临床病理资料与随访信息不完整者。从我院病理科系统收集所有手术患者的石蜡包埋组织样本，查阅病历记录患者的临床病理数据。本研究已通过我院医学伦理审查委员会批准（伦理号：NTFY2017-A09），所有患者签署知情同意书。

1.2 免疫组化染色与结果判定 将石蜡包埋的卵巢癌组织连续切割成4µm 厚的切片，二甲苯和梯度乙醇进行脱蜡和脱水。PBS洗涤切片后，在95 ℃的柠檬酸盐缓冲液（pH=6.0）中抗原修复30 min。在室温下使用3%H2O2溶液抑制内源性过氧化物酶活性15 min，并将切片与胎牛血清在室温下孵育30 min，阻断非特异性位点。PBS缓冲液多次洗涤切片后，分别加入1∶200 稀释的兔抗人多克隆GPR120 与GPR40（英国Abcam 公司）一抗，在4 ℃下孵育过夜。次日，向组织切片中加入1∶1 000稀释的辣根过氧化物酶标记的IgG二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司）继续孵育30 min。PBS 缓冲液洗涤切片后，使用二氨基联苯胺显色剂观察免疫染色，并用苏木精复染，中性树胶封片固定。

免疫组化染色的结果由2名研究人员根据染色强度与阳性染色细胞比例进行独立评分。染色强度评分分为4 个等级：阴性=0 分、弱（浅黄色）=1 分、中等（棕黄色）=2 分、强（棕色）=3 分；阳性染色细胞的比例分计分标准如下：＜25%=0分，25%~49%=1 分，50%~75%=2 分，>75%=3 分。将染色强度得分与阳性染色细胞比例得分相乘得到免疫组化染色的最终分数，其中＜4 分被定义为低表达，≥4 分被定义为高表达。如果2 位评价者的评分有不一致之处，则由第3 人进行复核，并协商得出相对最终结果。

1.3 随访 通过查阅门诊或住院病例以及电话探访等定期随访方式了解患者的生存状态。生存分析的主要研究结局为无病生存期（DFS），计算为患者自手术之日起直至因卵巢癌复发或死亡的时间节点。本研究的中位随访时间为41.0（33.0，49.0）个月，随访完成率100%。

1.4 统计学方法 使用SPSS 23.0 软件进行数据分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用独立样本t检验；分类变量以例（%）表示，组间比较采用χ2检验。使用Kaplan-Meier 方法进行生存分析，组间差异的比较采用Log-rank检验。Cox回归分析卵巢癌患者预后的影响因素。双侧P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GPR120、GPR40 蛋白在卵巢癌组织中的表达及其与临床病理特征的关系 免疫组化染色结果表明，两者主要在胞浆与胞膜中呈阳性表达，见图1。进一步分析发现，80 例（62.5%）患者GPR120 高表达，72例（56.3%）GPR40高表达。其中，FIGOⅡ—Ⅲ期和组织学G3 级患者的GPR120 和GPR40 高表达表达比例分别高于FIGOⅠ期与组织学G1—G2 级，见表1、2。

Fig.1 Immunohistochemical staining of GPR120 and GPR40 protein expression in ovarian cancer tissue(×400)图1 GPR120与GPR40蛋白在卵巢癌组织中的免疫组化染色结果（×400）

2.2 GPR120、GPR40 表达与卵巢癌患者预后的关系 随访期间，共有41 例（32.0%）患者出现肿瘤复发或因卵巢癌死亡，全组患者的4 年DFS 率为62.2%。生存分析表明，GPR120 高表达者的预后结局明显劣于低表达者，4 年DFS 率分别为56.9%和70.7%，差异有统计学意义（Log-rankχ2=5.144，P=0.023），图2A。此外，GPR40高表达者的4年DFS率亦显著低于低表达者，差异有统计学意义（57.7%vs.68.4%，Log-rankχ2=4.491，P=0.034），图2B。

2.3 影响卵巢癌患者DFS的Cox回归分析 以年龄（＜55 岁=0，≥55 岁=1），组织学分级（G1/G2=0，G3=1），肿瘤大小（＜5 cm=0，≥5 cm=1），腹水（＜100 mL=0，≥100 mL=1），FIGO分期（Ⅰ期=0，Ⅱ—Ⅲ期=1），术后残留灶大小（＜1 cm=0，≥1 cm=1），化疗（否=0，是=1），GPR120 表达（低表达=0，高表达=1），GPR40 表达（低表达=0，高表达=1）为自变量，以生存结局（生存=0，死亡=1）为因变量，进行单因素Cox回归分析。结果显示，组织学分级、肿瘤大小、FIGO 分期、术后残留灶大小、GPR120 表达和GPR40 表达与卵巢癌患者低DFS 显著相关。结合单因素分析结果，选取FIGO 分期、术后残留灶大小、GPR120 表达、GPR40表达进行多因素Cox 回归分析。结果显示，FIGO 分期Ⅱ—Ⅲ期、术后残留灶≥1 cm、GPR120 高表达与GPR40 高表达是卵巢癌患者DFS 的独立影响因素，见表3、4。

Tab.1 Comparison of GPR120 protein expression levels between ovarian cancer patients with different clinicopathological features表1 不同临床病理特征的卵巢癌患者GPR120蛋白表达水平比较

3 讨论

近年来，以手术联合化疗、靶向药物的综合治疗取得了很大进展，但卵巢癌患者仍面临着肿瘤复发和转移的严峻挑战。作为临床常用的血清肿瘤标志物，CA125 和HE4 对卵巢癌的诊断与预后评估并未显示出足够的特异性与敏感性［13］。因此，寻找能够评估卵巢癌生物学行为和患者预后，并作为潜在治疗靶点的可靠分子标志物具有重要临床意义。

Tab.2 Comparison of GPR40 protein expression levels between ovarian cancer patients with different clinicopathological features表2 不同临床病理特征的卵巢癌患者GPR40蛋白表达水平比较

Tab.3 Univariate Cox regression analysis of DFS for ovarian cancer patients表3卵巢癌患者DFS的单因素Cox回归分析

Fig.2 Relationship between GPR120 and GPR40 protein expression and DFS in ovarian cancer patients图2 GPR120、GPR40蛋白表达与卵巢癌患者DFS的关系

Tab.4 Multivariate Cox regression analysis of DFS for ovarian cancer patients表4 卵巢癌患者DFS的多因素Cox回归分析

GPR120 与GPR40 作为G 蛋白偶联受体家族中的成员，在调节脂质代谢、激素分泌和抗炎反应中发挥重要作用［10］。最近有研究发现两者在多种肿瘤中存在明显异常表达，并参与了肿瘤的发生与进展［14-16］。Cui 等［17］发现GPR120 在食管癌组织中的表达水平显著提升，与组织学分级、淋巴结转移和TNM 分期密切相关，下调GPR120 表达显著抑制了食管癌细胞在体外的增殖、迁移和侵袭能力，在体内动物模型中，GPR120表达沉默同样延缓了肿瘤的生长。Sun等［15］发现GPR120在胰腺癌中显著高表达，生存分析发现GPR120 高表达可以预测胰腺癌患者的不良预后。这些结果表明，GPR120可能发挥致癌作用，促进肿瘤的发生与转移。

GPR40 与人类癌症的关系亦被多项研究证实。Kleemann等［16］在114例石蜡包埋的黑色素瘤组织中研究了GPR40 蛋白的表达，结果发现与良性痣相比，黑色素瘤和黑色素瘤转移瘤中GPR40 表达更高，可作为黑色素瘤患者的独立预后标志物。此外，Nakashima等［18］检测了36例浆膜下浸润性结直肠癌中GPR40的表达，结果发现所有患者均有GPR40阳性表达，与淋巴结转移、远处转移（尤其是肝转移）、TNM 分期和不良预后呈正相关。在生物学功能方面，既往研究证实选择性抑制GPR40 受体的活性，可以明显降低黑素瘤、骨肉瘤细胞的运动性，抑制肿瘤的迁移［19］。这些研究结果表明GPR40 的异常激活可能是肿瘤进展的标志之一，以GPR40受体作为靶点有望成为未来抗肿瘤治疗的新方式。本研究重点探讨了GPR120与GPR40两者作为卵巢癌分子标志物的临床与预后意义，发现GPR120 与GPR40 在大多数卵巢癌组织中呈明显高表达，且与较高的组织学分级和进展的肿瘤分期相关。生存分析揭示GPR120 与GPR40 高表达是卵巢癌患者预后不良的独立预测因子。这些证据支持GPR120与GPR40参与卵巢癌发生发展过程的假设，为更好地理解两者在卵巢癌中的作用机制提供了研究基础。

综上所述，本研究证实了两种游离脂肪酸相关的G 蛋白偶联受体GPR120与GPR40在卵巢癌组织中的高表达，两者表达的增加与高组织学分级、FIGO 分期及不良预后显著相关。这些发现表明GPR120 与GPR40 是预测卵巢癌侵袭性与预后不良的有效分子标志物，两者可能参与了卵巢癌的恶性转化与进展。