NO介导的代谢紊乱影响小鼠气道祖细胞增殖的机制研究

郝德，李宽，王建海，岳青，陈怀永

呼吸时，由于吸入的空气中有各种病原微生物、有毒气体与颗粒物，使得气道上皮黏膜直接暴露其中，故易引发损伤。维持气道上皮黏膜结构和功能的完整性是维持正常呼吸功能的基础。与其他器官上皮黏膜相比，气道上皮黏膜再生能力较弱，但是受损后具有强大的修复能力［1］。在气道上皮黏膜修复过程中发挥主要作用的是club 祖细胞［2］，是肺内源性上皮祖细胞，特异性表达club 祖细胞分泌蛋白（club cell secretory protein，CCSP）。club祖细胞具有分泌和再生双重功能，可以分泌多种物质调节气道上皮黏膜的稳态，同时可以分化成其他上皮细胞，如纤毛细胞和杯状细胞［3］。研究表明，club 祖细胞功能异常与哮喘和慢性阻塞性肺疾病等多种肺部疾病病理学相关［4］。一氧化氮（NO）是一种重要的信号分子，参与许多正常的生理过程，但是呼出气中的NO 浓度是临床诊断哮喘严重程度的重要指标［5］。本课题组前期研究发现NO 抑制小鼠club 祖细胞增殖［6］。NO 还可破坏三羧酸循环和细胞代谢［7］，剥夺club 祖细胞糖摄取，抑制club 祖细胞增殖能力［8］。目前，NO对club祖细胞代谢功能的调控作用机制尚未阐明。本文采用肺脏类器官技术研究羟甲基戊二酸单酰辅酶A 还原酶（HMG-CoA reductase,Hmgcr）特异性抑制剂辛伐他汀、鸟苷单磷酸合成酶（Guanosine monophosphate synthase，Gmps）特异性抑制剂6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸（6-diazo-5-oxonorleucine，DON）和谷氨酸丙酮酸转氨酶2（Glutamate pyruvate transaminase 2，Gpt2）特异性抑制剂氨基羟乙酸酯（Aminooxyacetate，AOA）对原代club祖细胞增殖功能的影响，探究NO损伤原代club祖细胞增殖功能的可能代谢机制。

1 材料与方法

1.1 材料 8~12 周龄SPF 级雄性野生型C57BL/6 小鼠16只，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司［动物生产许可证号：SCXK（京）2019-0010］。小鼠饲养于天津大学海河医院实验中心SPF 级动物房内［动物使用许可证号：SYXK（津）2021-0002］。倒置荧光显微镜（Olypmus公司）。流式细胞术所用抗体：大鼠源抗小鼠CD24单克隆抗体、Ly-6A/E（Sca-1）单克隆抗体、EpCAM（CD326）单克隆抗体、CD31 单克隆抗体、CD34单克隆抗体、CD45单克隆抗体、APC-标记链霉亲和素偶联物购自eBioscience 公司。 弹性蛋白酶购自Worthington 公司。Transwell 培养小室、24孔板及96孔板，基质胶Matrigel 购自BD Pharmingen。DMEM-F12 培养基购自Corning 公司。胎牛血清（FBS）、青霉素-链霉素溶液（PS）购自Gibco 公司。HEPES 缓冲溶液、二乙胺壬酸酯（DEA NONOate）、Hmgcr 抑制剂辛伐他汀、Gmps 抑制剂DON 和Gpt2抑制剂AOA购自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠气道原代club 祖细胞分选 使用7.5%的水合氯醛溶液10 µL/g 腹腔注射麻醉小鼠，剪断腹主动脉后处死小鼠，收取肺组织。弹性蛋白酶注入气管进行消化，切碎肺组织并制备小鼠肺单细胞悬液后加入混匀的荧光标记抗体CD24、CD31、CD34、CD45、EpCAM 和Sca-1，然后冰上孵育30 min。使用BD Ario Ⅲ流式细胞仪，根据以下表型分选CD24lowCD31-CD34-CD45-EpCAM+Sca-1+小 鼠 原 代club 祖细胞。

1.2.2 转录组测序 将分选的小鼠原代club 祖细胞种入基质胶包被的96孔板中（每孔含100µL基质胶，1.9×105个原代club祖细胞），设置对照组和DEA NONOate 刺激组，每组3个孔。本实验选用DEA NONOate浓度为25µmol/L，相当于重症哮喘患者支气管灌洗液中高剂量NO 的浓度［9-10］。刺激24 h后，进行细胞转录组测序，由北京诺禾致源科技股份有限公司协助完成。转录组数据使用Deseq R软件包筛选差异变化基因，以矫正后的P＜0.05为标准，使用clusterProfiler 筛选差异表达倍数上调1.2倍以上和下调16.7%以上的基因。

1.2.3 肺脏类器官模型培养 将分选的原代club 祖细胞与小鼠肺成纤维细胞（MLg 细胞）按比例（每个小室5 000 个原代club祖细胞，2×105个MLg细胞）混匀后种入小室内。设置实验组与对照组，对照组使用干细胞培养基（DMEM/F12，10%FBS，1×青霉素-链霉素溶液）培养，实验组使用添加抑制剂的培养基培养，参考文献［11-13］确定抑制剂浓度如下：辛伐他汀40 nmol/L，DON 0.2 µmol/L，AOA 1 mmol/L。每组不少于5 个复孔，每2 d 换1 次培养基，辛伐他汀组、DON 组和AOA组第2天添加相应抑制剂开始刺激。培养第8天用倒置显微镜拍照，Cellseens Dimension 软件处理分析图像，统计直径大于50µm的类器官的个数及直径，并计算类器官形成效率（原代club祖细胞形成类器官的百分比）。

1.3 统计学方法 采用SPSS 16.0 进行数据分析，计量资料以±s表示，组间比较采用t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠气道原代club 祖细胞的分选与肺脏类器官模型的建立 小鼠气道原代club祖细胞被成功分选。将分选出的原代club祖细胞与MLg细胞混匀至Matrigel 基质胶与F12培养基中，植入Transwell 小室内培养。培养第8天原代club祖细胞可长成中空透明的球状结构——类器官，见图1。

2.2 NO对原代club祖细胞中多种代谢基因表达的抑制作用 转录组测序结果显示，与对照组相比，DEA NONOate 刺激组原代club 祖细胞上调1.2 倍以上的基因有2 894 个，下调16.7%以上的基因有3 270 个，见图2。分析差异基因的fpkm 值（即每千个碱基的转录每百万映射读取的碎片数，反映基因表达水平），在这些差异表达基因中，DEA NONOate刺激后，原代club祖细胞代谢相关基因Hmgcr（n=3，t=3.131，P＜0.01）、Gmps（n=3，t=10.403，P＜0.01）和Gpt2（n=3，t=9.850，P＜0.01）的表达下降，见图3。

2.3 辛伐他汀对原代club 祖细胞增殖的影响 类器官培养结果显示，辛伐他汀组原代club 祖细胞的类器官形成效率（6.44%±0.36%）与对照组的（6.44%±0.40%）比较差异无统计学意义（n=6，t=0.079，P＞0.05），辛 伐 他 汀 组 的 类 器 官 直 径（220.88 µm±10.16 µm）较 对 照 组（260.09 µm±14.15µm）减小（n=6，t=6.070，P＜0.01），见图4。

2.4 Gmps抑制剂DON对原代club祖细胞增殖功能的影响 DON 组原代club 祖细胞的类器官形成效率（3.98%±0.33%）较对照组（6.62%±0.54%）降低（n=5，t=16.535，P＜0.01），DON 组的类器官直径（118.23µm±6.68µm）较对照组（208.21µm±10.28µm）减小（n=5，t=19.849，P＜0.01），见图5。

2.5 Gpt2 抑制剂AOA 对原代club 祖细胞增殖功能的影响 AOA组的类器官形成效率（2.28%±0.32%）较对照组（4.97%±0.44%）降低（n=5，t=8.409，P＜0.01），AOA 组的类器官直径（94.05µm±5.98µm）较对照组（222.39 µm±21.21 µm）减小（n=5，t=12.180，P＜0.01），见图6。

Fig.1 Flow sorting strategy of mouse airway club cells and organoid culture model图1 小鼠气道原代club祖细胞流式分选策略与类器官培养模型

3 讨论

NO是一种功能作用机制多样的自由基分子，在调节细胞代谢与氧化应激等多方面发挥重要作用。在哮喘等气道疾病中，NO代谢异常是气道炎症病理学表现的原因之一［14］。本课题组前期应用类器官模型发现，哮喘过程中常见的高浓度NO抑制小鼠气道上皮原代club祖细胞的增殖能力［6］。本研究结果显示，高浓度NO抑制小鼠原代club祖细胞代谢相关基因Hmgcr、Gmps和Gpt2的表达。Hmgcr 催化乙酰辅酶A（Acetyl-CoA）的下游产物羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原生成甲羟戊酸［15］，控制细胞胆固醇合成［16］；Gpt2催化三羧酸循环中α-酮戊二酸生成谷氨酸［17］；Gmps 催化谷氨酰胺生成鸟嘌呤核苷酸［18］。本研究利用类器官模型研究发现，利用小分子抑制剂抑制Hmgcr、Gmps 和Gpt2的活性可显著降低原代club 祖细胞类器官大小，提示原代club 祖细胞增殖依赖于这3 条代谢通路。抑制Gpt2 或者Gmps 的活性导致原代club祖细胞类器官形成效率下降，提示Gpt2和Gmps 代谢通路有助于原代club 祖细胞维持自我更新能力。因此，高剂量NO损害小鼠气道祖细胞再生功能可能与其抑制Hmgcr、Gmps 和Gpt2 代谢有关。Hmgcr 控制细胞胆固醇合成，而胆固醇在促进有丝分裂的发生发展中发挥重要作用。目前已有研究发现，胆固醇是小肠干细胞的有丝分裂原之一，促进小肠干细胞增殖［19］。Gpt2 可以促进多种癌细胞的增殖［20-21］。使用Gmps 抑制剂可以抑制人前列腺癌细胞的生长［18］。在影响细胞增殖能力方面，既往对这3个基因的研究结果与笔者在原代club 祖细胞上观察到的表现一致。

气道上皮黏膜的稳态维持与损伤后修复需要club 祖细胞保持较强的增殖能力。对于哮喘患者，气道上皮黏膜的修复受阻是导致炎症持续的原因［22］。有研究表明，气道上皮黏膜修复受阻与哮喘患者呼出气体中的NO 水平增高有关［23］。本研究发现，高剂量NO的损伤作用可能与其抑制脂代谢与核苷酸代谢途径Hmgcr、Gmps 和Gpt2 有关。可见，气道高剂量NO 的持续存在对气道上皮黏膜损伤后的修复是不利的。还有研究表明，NO依赖性的线粒体损伤及腺苷三磷酸合成的减少可以导致持续的上皮细胞损伤与后续炎症反应的增加［24］。核苷酸合成功能维持在正常水平是保证气道上皮细胞代谢、纤毛细胞清除作用正常的基础，而这两种作用对维持气道稳态、对抗慢性阻塞性肺疾病引起的功能失调起重要作用［25］。新型冠状病毒在早期感染气道上皮细胞，造成上皮黏膜损伤也可能与脂代谢异常下降有关［26］。因此，异常的脂代谢和核苷酸代谢可能是造成上皮黏膜结构和功能受损的重要原因。

Fig.2 The differential change genes of club cells after NO stimulation图2 NO刺激后原代club祖细胞差异变化基因火山图

Fig.3 The effect of NO on the expression of metabolic genes in mouseclub cells图3 NO对小鼠原代club祖细胞相关代谢基因表达的影响

Fig.4 The effect of simvastain on the size of mouse club cell-derived organoids(×40)图4 辛伐他汀对小鼠原代club祖细胞增殖功能的影响（×40）

Fig.5 The effect of DON on the size of mouse club cell-derived organoids(×40)图5 DON对小鼠原代club祖细胞增殖功能的影响（×40）

Fig.6 The effect of AOA on the size of mouse club cell-derived organoids(×40)图6 AOA对小鼠原代club祖细胞增殖功能的影响（×40）

综上所述，脂质代谢和核苷酸代谢与club 祖细胞的增殖功能密切相关，高剂量NO刺激可导致club祖细胞代谢功能的紊乱，进一步引起其增殖能力受损。以NO信号为靶点，缓解NO对气道上皮黏膜损伤作用可为重症哮喘患者气道上皮损伤的临床治疗提供可能方案。

本研究仍存在一些局限性，如NO在哮喘进程中发挥着复杂的作用，本研究利用体外类器官培养只模拟了单一代谢因素对原代club祖细胞增殖功能的影响，而对目前已知的NO在氧化应激等其他方面发挥的作用没有纳入；NO对原代club祖细胞功能的调控可能存在多种机制，而且与其剂量有关，本研究没有关注低剂量NO对气道上皮再生修复的影响。