基于AQP8、NHE3、CFTR探究参苓白术散对腹泻幼鼠模型肠黏膜的保护作用及机制
2023-05-08王彦彬王晓颖徐国娟戚敏敏梁翠才马玮玮
王彦彬,王晓颖,徐国娟,戚敏敏,梁翠才,马玮玮
(河西学院,甘肃 张掖 734000)
腹泻的临床发病率较高,是由于多种原因造成的水、电解质转运失常,常表现为大便次数增多、大便性状变化,多发生于6 个月~2 岁的儿童群体中[1]。水通道蛋白( aquaporins,AQPs) 是肠上皮细胞膜上负责跨细胞转运水分子的主要蛋白[2]。跨膜转运蛋白钠氢交换体(Na+/H+ exchangers,NHEs)是肠道对Na+的吸收蛋白,可促进肠道对Na+的吸收,进而形成浓度梯度。Cl-的肠道吸收和分泌与囊性纤维化跨膜传导调节因子(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator,CFTR)通道有关[3]。研究[4]发现,腹泻时,肠道黏膜中AQPs、NHEs、CFTR 会出现异常表达,使肠道黏膜对H2O、Na+、Cl-的通透性增加,致使水、电解质在肠道内大量聚集。参苓白术散属于常用的经典中药方剂,目前广泛用于小儿腹泻的治疗,多数患儿可从中获益。但对于参苓白术散是否可通过影响肠黏膜AQPs、NHEs 和CFTR 的表达来治疗腹泻,目前尚未见报道[5]。本实验通过检测腹泻幼鼠模型结肠黏膜AQP8、NHE3 和CFTR 的表达情况,探讨参苓白术散的止泻作用机制,旨在为参苓白术散治疗小儿腹泻提供现代医学理论证据,现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
购置雄性SD 幼鼠50 只,随机取10 只设为正常组。其余40 只SD 幼鼠于每日上午予番泻叶药液灌胃,连续干预14 d,建立幼鼠腹泻模型;建模成功后分为模型组、参苓白术散低、中、高剂量组,每组10 只。50 只SPF 级雄性SD 幼鼠的体重为80 ~100 g,平均(90.00±10.00)g。所有幼鼠均购自甘肃兰州兽研所。所有幼鼠均进行1 周的适应性喂养,控制室温在24 ~26℃,自由进食饮水,适应性饲养1 周后开始实验。
1.2 仪器与设备
(1)药物及试剂:参苓白术散(购于北京德寿堂医药有限公司,人参15 g、茯苓15 g、白术15 g、白扁豆12 g、山药12 g、莲子9 g、砂仁6 g、炙甘草9 g);番泻叶(购于吉林省松辽制药有限公司);AQP8、NHE3、CFTR 一抗(购于北京博奥森生物科技有限公司);苏木素- 伊红(HE)染色液(购于南京建成生物工程研究所)。番泻叶水煎剂的制备:精确称取番泻叶400 g 浸泡于2000 mL 纯净水中,搅拌均匀后静置30 min;用武火煮沸10 min,使其浓缩至1200 mL,用4 层纱布进行过滤后即完成番泻叶药液的制备,药物浓度最终为0.3 g/mL,置于4℃冰箱中备用。(2)实验仪器:高速冷冻离心机、电泳仪、电泳槽、UVP凝胶成像系统、半干转膜仪系统、切片机。
1.3 方法
(1)动物分组。将50 只SPF 级雄性SD 幼鼠(体重80 ~100 g)分为正常组、模型组、参苓白术散低、中、高剂量组,每组10 只。除正常组外,其余各组用番泻叶药液灌胃,根据参考文献[6]确定番泻叶药液的浓度为0.3 g/mL。按10 mL/kg 灌胃,每日1 次,连续干预14 d,建立幼鼠腹泻模型。正常组予等量蒸馏水灌胃。(2)给药方法。为参苓白术散低、中、高剂量组使用参苓白术散药液灌胃,给药体积均为10 mL/kg ;低剂量组的给药剂量为1.2 g/kg,中剂量组的给药剂量为2.3 g/kg ;高剂量组的给药剂量为4.6 g/kg。正常组、模型组予等量蒸馏水灌胃。各组均连续灌胃14 d。每3 天完成1 次体重称量,并动态调整药物剂量。同时,给药过程中观察幼鼠情况,并完成粪便的收集。(3)标本采集。对各组幼鼠进行灌胃后,以3.5% 水合氯醛(10 mL/kg)完成麻醉,取远端结肠组织,常规清洗,一部分置于福尔马林液中浸泡,一部分置于-80℃冰箱中冻存。
1.4 观察指标
(1)幼鼠表征观察。每日观察并记录幼鼠的皮毛色泽、活动状态和粪便性状;称量幼鼠的体重,计算其腹泻指数。(2)HE 染色情况。取各组幼鼠的结肠组织,经石蜡组织固定后完成切片的制备,并进行常规的HE 染色,于光镜下观察结肠的病理改变情况[7]。(3)结肠黏膜的AQP8、NHE3 和CFTR 表达。用免疫组织化学法检测各组结肠黏膜AQP8、NHE3和CFTR 的表达情况。用Western blot 法检测各组结肠黏膜中AQP8、NHE3 和CFTR 的含量[8]。
1.5 统计学分析
采用SPSS 21.0 统计学软件进行数据分析,计量资料用均数± 标准差(±s)表示,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验;以P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组幼鼠的一般情况
2.1.1 幼鼠表征观察 正常组幼鼠行动灵活,精神状态良好,饮食正常,毛发浓密有光泽,大便正常。与正常组比较,模型组幼鼠行动迟缓,精神萎靡不振,毛发稀疏,伴有毛发脱落,肛门红肿、周围体毛有少量稀便沾染。与模型组相比,参苓白术散低、中、高组幼鼠的行动灵活性、精神状态、毛发光泽度等情况均得到不同程度的改善。见图1。
图1 各组幼鼠表征
2.1.2 各组幼鼠体重、腹泻指数的比较 正常组幼鼠体重增长迅速,模型组幼鼠体重增长缓慢,且差异明显(P<0.05)。参苓白术散各组体重均有明显的增长;参苓白术散组的腹泻指数低于模型组(P<0.05)。见表1。
表1 各组幼鼠体重、腹泻指数的比较(± s)
表1 各组幼鼠体重、腹泻指数的比较(± s)
注:a 与正常组比较,P <0.05 ;b 与模型组比较,P <0.05。
组别 只数 体重(g)腹泻指数造模前 干预后 造模前 干预后参苓白术散组低剂量组 10 102.98±9.52 138.41±15.67ab 0.00±0.00 0.63±0.14ab中剂量组 10 103.11±9.56 140.39±15.69ab 0.00±0.00 0.65±0.16ab高剂量组 10 103.03±9.53 139.63±15.68ab 0.00±0.00 0.64±0.15ab模型组 10 103.52±9.56 114.39±12.31a 0.00±0.00 0.85±0.14a正常组 10 102.99±9.51 142.98±16.72 0.00±0.00 0.00±0.00
2.1.3 各组幼鼠粪便的变化情况 除正常组外,其他组幼鼠在予番泻叶药液灌胃3 天后均出现粪便呈湿软质黏状态、附着于滤纸上的情况。5 天后粪便成为夹杂黏液的水样稀便,且排便次数增加。正常组的粪便为质硬椭圆形粪便。与正常组相比,其他组幼鼠的粪便含水量和腹泻指数均明显更高。参苓白术散各剂量组给予相应药物干预3 天后,粪便基本成形,质地湿软。5 天后粪便皆为成形便,含水量明显下降,但是与正常组的粪便相比,还是偏松软。见图2。
图2 参苓白术散各剂量组幼鼠的大便性状
2.2 各组幼鼠结肠黏膜的形态学变化
与正常组比较,模型组幼鼠的结肠黏膜表皮细胞坏死明显,且其结肠黏膜伴有毛细血管的扩张,存在少许中性粒细胞的浸润;与模型组比较,参苓白术散各剂量组幼鼠的结肠黏膜表皮细胞凋亡坏死、固有层毛细血管扩张充血和中性粒细胞浸润现象明显改善。见图3。
图3 各组幼鼠结肠黏膜的形态学变化
2.3 免疫组化法检测AQP8、NHE3 和CFTR 的表达情况
与正常组比较,模型组幼鼠结肠黏膜AQP8、NHE3 的表达下降,CFTR 的表达升高。与模型组比较,参苓白术散各剂量组幼鼠结肠黏膜AQP8、NHE3的表达明显升高,而CFTR 的表达明显下降。见图4。
图4 免疫组化法检测AQP8、NHE3 和CFTR 的表达情况
2.4 Westernblot 法检测AQP8、NHE3 和CFTR的含量
与正常组比较,模型组幼鼠结肠黏膜AQP8、NHE3 的含量减少,CFTR 的含量增加。与模型组比较,参苓白术散各剂量组幼鼠结肠黏膜AQP8、NHE3的含量明显增加,而CFTR 的含量明显减少,差异有统计学意义(P<0.05)。见图5。
图5 各组幼鼠结肠黏膜中AQP8、NHE3 和CFTR 含量的比较
3 讨论
发生腹泻时,常会并发脱水、电解质及酸碱平衡紊乱。结肠是肠道中吸收水和电解质的主要场所,AQPs 的作用主要是调节胃肠道内的水液代谢,维持机体内水液含量的相对稳定[9]。哺乳类动物的已知AQPs 有13 种。在其胃肠道中,至少存在11 种AQPs。其中AQP1、AQP3、AQP8 在结肠中的表达水平较高,其表达水平能直接影响消化道疾病的发生和发展[10]。既往研究表明,AQP1、AQP3、AQP8 的表达水平与结肠的水液代谢有关。NHEs 共有9 个亚型。其能参与上皮细胞盐的运输,从而影响细胞中pH值、细胞体积。NHEs 是一种跨膜转运蛋白,其生理作用是使Na+转运到细胞外的同时使H+转运到细胞内。其是肠道对Na+的吸收蛋白,可促进肠道对Na+的吸收,进而形成浓度梯度。Na+是维持组织液、血浆渗透压、肠黏膜内外水电解质平衡的关键因素[11]。肠道对电解质的吸收,主要是建立在对Na+吸收的基础上。CFTR 是ATP 结合盒转运蛋白(ATP-binding cassette,ABC)超家族中的一种,其作用机制的关键是为氯离子跨上皮运动提供了选择性通道[12]。在本实验中,我们发现与正常组相比,模型组幼鼠结肠黏膜AQP8 和NHE3 的表达水平显著降低,而CFTR 的表达水平显著升高,说明腹泻可能与AQP8 和NHE3的表达水平降低、CFTR 的表达水平升高有关。与模型组比较,参苓白术散各剂量组幼鼠结肠黏膜AQP8、NHE3 的含量明显增加,而CFTR 的含量明显减少,说明参苓白术散可能是通过上调AQP8 和NHE3 的表达水平、下调CFTR 的表达水平来起到止泻的作用。
综上所述,参苓白术散可通过调节幼鼠肠黏膜AQP8、NHE3、CFTR 的表达水平来促进其体内的水液代谢,并能减轻结肠黏膜受损,起到止泻的作用。