麝香保心丸通过JAK2/STAT3信号通路对兔急性心肌梗死血管再生的作用与机制研究

祝 慧，牟强强，徐会圃

（滨州医学院附属医院心血管内科，山东 滨州 256603）

心血管疾病是世界范围内导致人们死亡的主要疾病，其中急性心肌梗死（Acute Myocardial Infarction，AMI）是冠心病最严重的类型，在所有心血管疾病中致死率最高[1]。虽然AMI 的治疗策略在过去几十年中已经得到了很大改善，但仍存在很多局限性。中药防治冠心病由来已久，麝香保心丸（SBP）是其中的代表性药物[2]，具有改善血管内皮功能、舒张血管、调节冠状动脉血流量、增加心肌供血、抑制炎症因子释放、调节氧化应激状态等作用[3]，但其具体机制仍不清楚。JAK2/STAT3 通路参与了包括细胞生长、分化、增殖、凋亡和炎症等多个生理过程。以往的研究表明，JAK2/STAT3 信号通路可以调控细胞周期进展和血管生成相关基因的表达，参与心肌梗死后的血管新生[4]。但关于麝香保心丸对AMI 后血管再生的具体机制是否与JAK2/STAT3 信号通路有关尚不清楚。基于此，本研究就麝香保心丸通过JAK2/STAT3 信号通路对兔AMI血管再生的作用与机制进行探讨与分析，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

纯种雄性新西兰大白兔，购于济南西岭角生物科技有限公司，体重2 ～2.5 kg，实验动物许可证号：SCXK（鲁）2020-0004。将白兔分笼饲养于滨州医学院附属医院动物实验中心，温度保持在20 ～25 ℃，湿度保持在50% ～70%。每天12 h 轮换照明，所有白兔均自由饮水，每天2 次按时按量喂养饲料。

1.2 主要试剂及仪器

试剂：水合氯醛，购于滨州医学院附属医院；AG490，购于美国AbMole 公司；VEGF 抗体，购自Proteintech 公司；Ang-1 抗体，购自AFFINITY 公司；JAK2 抗体，购于ZBNBIO 公司；STAT3 抗体，购于HUABOIO 公司。仪器：荧光定量PCR 仪、电泳槽、电转装置、电泳仪，购于Biorad 公司；台式低温离心机，购于德国Eppendorf 公司；Micro Gmbh 切片机，购于德国Microm International GmbH 公司；显微镜、Motic 医学图像分析系统，购于日本OLYMPUS 公司。

1.3 方法

1.3.1 动物造模 术前所有实验动物均禁食不禁水8 h，称重。将兔置于兔箱内，清理耳缘静脉附近的兔毛，以10% 水合氯醛（3 mL/kg）耳缘静脉麻醉。将兔固定于手术台上，连接心电图机记录肢体导联心电图。清理胸前区兔毛，碘伏消毒，找到心脏搏动最强点，在心脏搏动最强点处做一长约3 cm 的手术切口，逐层分离肌肉，阔开肋骨，暴露心脏，找到冠状动脉左前降支，用6-0 手术缝线在冠状动脉左前降支约1/2处结扎，CON 组只穿线不结扎。术后用4-0 手术缝线逐层关胸，记录肢体导联心电图，相应导联ST 段抬高表示造模成功。腹腔注射80 万单位青霉素预防感染。

1.3.2 分组及给药 采用随机数表法，将实验动物分为5 组（n=10）。CON 组不结扎冠状动脉左前降支，术后每天以3 mL 生理盐水灌胃；其余4 组均结扎冠状动脉左前降支，其中AMI 组每天以3 mL 生理盐水灌胃，SBP 组每天以50 mg/kg 的剂量将麝香保心丸溶于3 mL 生理盐水中灌胃，AG 组每天以0.4 mL/kg 的剂量皮下注射AG490 并给予3 mL 生理盐水灌胃，S+A组每天以50 mg/kg 的剂量将麝香保心丸溶于3 mL生理盐水中灌胃，并以0.4 mL/kg 的剂量皮下注射AG490。

1.3.3 标本采集 术后第7 d，将耳缘静脉麻醉实验用兔沿原手术切口取出心脏，用PBS 缓冲液冲洗干净，留取梗死区及梗死周围区的心肌组织，用4% 的多聚甲醛对部分心肌组织进行固定，经苏木素-伊红（HE）染色观察心肌梗死区的病理变化及炎症反应，经免疫组化（IHC）观察血管内皮生长因子（VEGF）、血管紧张素Ⅰ（Ang-Ⅰ）及磷酸化酪氨酸激酶2（p-JAK2）、磷酸化信号传导子及转录激活子3（p-STAT3）的表达以及CD31 阳性的微血管密度（Microvascular density，MVD）；部分液氮速冻用于检测JAK2、STAT3 的mRNA 及蛋白表达水平。

1.3.4 心肌组织病理变化 心肌组织经多聚甲醛固定24 h 后取出，制备常规石蜡包埋切片，行HE 染色后在200 倍光镜下观察病理改变。

1.3.5 心肌组织中血管生成因子及p-JAK2、p-STAT3的表达 心肌组织切片后常规脱蜡、水化、抗原修复及封闭内源性过氧化物酶活性。滴加稀释好的一抗（稀释比例：VEGF 1:250、Ang-1 1:400、p-JAK2 1:100、p-STAT3 1:100），4 ℃孵育过夜，37 ℃复温30 min，滴加二抗，37 ℃孵育30 min，经DAB 显色、苏木素复染等步骤后封片。显微镜下观察, 胞浆出现棕黄色即为阳性。统一图像采集条件，200 倍光镜下，每张切片选取5 个不重叠视野进行观察，并应用Image Pro Plus 6.0 图像分析软件进行分析。

1.3.6 心肌组织MVD 的测定 心肌组织脱水、包埋、切片后经IHC 染色，CD31 工作浓度为1:300，DAB显色，染色后血管内皮细胞被染成棕黄色。400 倍光镜下，每张切片随机选取5 个视野进行观察，MVD的计数方法参照Weidner 法[5]。

1.3.7 心肌梗死边缘区JAK2 及STAT3 的蛋白表达

取冻存管内的心肌组织，放在研钵中研磨裂解，于4 ℃离心机中离心10 min 后取上清液。100 ℃变性处理后取等量蛋白经SDS-PAGF 电泳分离, 转移至NC膜上, 37 ℃下封闭1.5 h。加入1:1000 稀释的JAK2、STAT3 及β-actin 一抗，4 ℃孵育过夜，再加入二抗37 ℃孵育2 h。以ECL 发光显影，采用凝胶成像系统拍照分析。运用Image J 软件分析条带的灰度值，实验重复三次，取平均值。

1.3.8 心肌组织中JAK2、STAT3 的mRNA 表达 取冻存管内的心肌组织，按照RNA 提取试剂盒的说明书提取mRNA，随后经逆转录、qRT-PCR 等步骤，得到JAK2、STAT3 及内参基因的Ct 值。引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司设计并合成，以GAPDH 作为内参，通过2-△△Ct 法比较各组心肌组织中JAK2、STAT3 的mRNA 相对含量。

1.4 统计学处理

采用SPSS 27.0 及GraphPad Prism 8.0 统计学软件进行统计学分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LDS 法分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 麝香保心丸对兔AMI 模型心肌组织病理状态的影响

如图1 所示，CON 组心肌细胞染色均匀，细胞结构完整，细胞核呈椭圆形，心肌纤维排列整齐，清晰可见，无中性粒细胞浸润。AMI 组心肌细胞排列紊乱，细胞核显示不清，心肌纤维溶解断裂，间质中可见中性粒细胞浸润。SBP 组可见心肌细胞排列好于AMI 组，差于CON 组，细胞核多数可见，心肌纤维呈波浪样变，未见明显断裂现象，且有纤维修复现象。AG 组心肌细胞排列差于AMI 组，细胞结构破坏更加明显，细胞核消失，心肌纤维明显紊乱，中性粒细胞浸润明显。S+A组心肌细胞排列好于AG 组，差于SBP 组。

图1 HE 染色×200 结果

2.2 麝香保心丸对兔AMI 模型心肌血管再生因子及p-JAK2、p-STAT3 表达的影响

如图2 至图5 所示，CON 组棕黄色染色分布稀疏，染色浅；与CON 组相比，AMI 组染色明显加深；与AMI 组相比，SBP 组染色更深，而AG 组染色最浅；S+A 组染色较SBP 组浅，但较AG 组深。如图6 所示，与CON 组相比，AMI 组VEGF、Ang- Ⅰ、p-JAK2、p-STAT3 蛋白的MOD 值均升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；SBP 组上述4 种蛋白的平均光密度（MOD）值最高，AG 组最低，差异均有统计学意义（P＜0.05）；S+A 组上述4 种蛋白的MOD 值较SBP 组低，但较AG 组高，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图2 VEGF 蛋白的表达情况×200

图3 Ang-1 蛋白的表达情况×200

图4 p-JAK2 蛋白的表达情况×200

图5 p-STAT3 蛋白的表达情况×200

图6 VEGF、Ang Ⅰ及p-JAK2、p-STAT3 的MOD 值（mean±SD）

2.3麝香保心丸对兔AMI 模型心肌CD31 阳性MVD 的影响

如图7 至图8 所示，AMI 组左室梗死边缘区的CD31 阳性MVD 大于CON 组，但差异无统计学意义（P＞0.05）；与AMI 组相比，SBP 组左室梗死边缘区的CD31 阳性MVD 明显增大，而AG 组明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05）；与S+A 组相比，SBP组左室梗死边缘区的CD31 阳性MVD 增大，而AG 组降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图7 CD31 阳性血管的分布情况×400

图8 CD31 阳性的MVD（mean±SD）

2.4 麝香保心丸对兔AMI 模型心肌JAK2、STAT3的mRNA 及蛋白表达的影响

如图9 至图11 所示，与CON 组相比，AMI 组中JAK2 的mRNA 及蛋白表达水平均升高，差异有统计学意义（P＜0.05），而STAT3 的mRNA 及蛋白表达虽较CON 组高，但差异无统计学意义（P＞0.05）；与AMI 组相比，SBP 组JAK2、STAT3 的mRNA 及蛋白表达水平均明显升高，而AG 组下降，差异有统计学意义（P＜0.05）；与S+A 组相比，SBP 组JAK2、STAT3 的mRNA 及蛋白表达水平均升高，而AG 组降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图10 JAK2、STAT3 蛋白的表达情况

图11 JAK2、STAT3 mRNA 的扩增情况

3 讨论

AMI 是缺血性心脏病（IHD）中最危重的一种类型。在我国，AMI 的发病率不断攀升，并且有年轻化的趋势[6]。近年来，随着溶栓、经皮冠状动脉介入治疗（PCI）及CAPG 技术的普及，心肌梗死患者急性期的死亡率正逐年下降[7]。然而，各种损伤因素常导致损伤区域的MVD 显著降低，进一步加重心肌损伤。在此背景下，如何促进梗死区的血管再生已成为目前AMI 治疗的重要研究方向。在AMI 的修复过程中，我们可以看到冠状动脉侧支循环的形成[8]，然而，机体自身生成的新血管往往不足以代偿。因此，刺激缺血区小血管生长，完成缺血区血管的自我搭桥便成为了重要的治疗方法[9]。相关的研究表明，在缺血区血管生成的过程中，JAK2/STAT3 通路对于血管生长因子的激活起到关键作用。麝香保心丸是根据中医络病理论研制的经典复方制剂[10]，它可以通过调控Notch/Delta、Hippo-YAP 等血管新生相关的信号通路，发挥治疗性血管新生的作用[11]。JAK2/STAT3通路对心肌细胞的存活、凋亡及心室重塑有重要影响[12]。研究表明，JAK2/STAT3 信号通路可以促进血管生成相关基因的表达，参与AMI 后血管新生[4]。因此我们推测，麝香保心丸促进血管再生的作用部分能通过激活JAK2/STAT3 信号通路实现。本研究中我们发现，心肌梗死后的HE 染色病理切片用麝香保心丸干预后，心肌横纹模糊不清但未见明显断裂，且可以看到纤维修复现象，表明心肌组织损伤坏死程度比AMI 组小，修复速度较AMI 组快。AG 组心肌细胞排列比AMI 组差，细胞结构破坏更加明显，细胞核消失，中性粒细胞浸润较AMI 组更加明显，表明AG490 可以阻断JAK2/STAT3 通路介导的心肌保护作用。S+A组心肌细胞排列好于AG 组，差于SBP 组，表明麝香保心丸对心肌的保护作用部分可被AG490 抑制，也进一步说明麝香保心丸发挥心肌保护作用可能与JAK2/STAT3 信号通路有关。此外，我们采用IHC 形象地显现VEGF 及Ang-1 在心肌组织中的分布，结果显示，AMI 组VEGF 的蛋白表达水平较CON 组升高（P＜0.05），表明AMI 可激发VEGF 的表达；与CON 组相比，SBP 组VEGF 及Ang-1 的蛋白表达水平均明显增加（P＜0.05），表明麝香保心丸有促进血管新生的作用；AG 组则明显下降（P＜0.05），表明AMI 后的血管新生与JAK2/STAT3 信号通路有关；AG490 干预后，SBP 组上述因子的蛋白表达水平较前下降（P＜0.05），表明AG490 可以逆转麝香保心丸的作用，提示麝香保心丸可通过JAK2/STAT3 信号通路发挥促进血管生成的作用。

MVD 是反映侧支循环的最可靠指标。因此，本研究中我们检测了CD31 阳性的MVD，结果显示，AMI 组CD31 阳性的MVD 较CON 组减少（P＜0.05），表明AMI 并没有使有功能的新生血管密度增加；SBP组CD31 阳性的MVD 较CON 组明显增加（P＜0.05），表明麝香保心丸可以促进AMI 后有功能的血管新生，这种作用可被AG490 阻断，进一步证实麝香保心丸对血管再生的促进作用是通过JAK2/STAT3 信号通路实现的。本研究中我们用qRT-PCR 及western blot 测定了JAK2、STAT3 mRNA 及蛋白的相对表达量，结果显示，AMI 组JAK2 的mRNA 及蛋白表达量均高于CON 组（P＜0.05），表明AMI 可刺激损伤区域心肌细胞JAK2 的mRNA 及蛋白表达，AMI 组STAT3 的mRNA 及蛋白表达量虽然高于CON 组，但差异无统计学意义；SBP 组JAK2、STAT3 的mRNA及蛋白表达量均较AMI 组高（P＜0.05），意味着麝香保心丸可以增加JAK2、STAT3 的mRNA 及蛋白表达量；S+A 组损伤区域心肌组织中JAK2、STAT3的mRNA 及蛋白表达量均较SBP 组低（P＜0.05），且均较AG 组高（P＜0.05），表明AG490 可部分阻断麝香保心丸的作用，更加证实了麝香保心丸可通过激活JAK2/STAT3 信号通路增加其mRNA 及蛋白的表达量，发挥心脏保护作用。JAK2、STAT3 激活后以p-JAK2、p-STAT3 的性质存在，我们通过IHC 形象地显示p-JAK2、p-STAT3 在心肌组织的表达与分布，结果显示，AMI 组的p-JAK2 染色较CON 组深，但p-STAT3 染色较对照组差异不明显；与AMI 组相比，AG 组颜色最浅，SBP 组颜色最深，表明麝香保心丸不仅可以促进JAK2/STAT3 信号通路的表达，还可以促进JAK2、STAT3 的磷酸化；S+A 组染色较SBP 组浅，较AG 组深，表示麝香保心丸对JAK2、STAT3 的活化可被AG490 阻断。同时，我们用MOD 值来定量计算蛋白表达量，也支持上述结论。

总之，由前面的实验可以得出，麝香保心丸可保护新西兰大白兔AMI 后损伤区域心肌组织解剖结构的完整性，增加VEGF 及Ang- Ⅰ的表达，发挥促进血管新生的作用。这种作用与JAK2/STAT3 信号通路的激活及p-JAK2 和p-STAT3 表达的增加有关。这一研究为麝香保心丸促进AMI 后血管再生提供了基础研究证据，为临床治疗AMI 提供了一条新的线索。