基于腊叶标本分析的木姜叶柯表型性状变异及地理分化研究

赵鹏霞，杨 旭，杨志玲，田朝霞，羊奕珣

（1.中国林业科学研究院 亚热带林业研究所，浙江 杭州 311400；2.河北农业大学 园艺学院，河北 保定 071000；3.浙江省林木育种技术研究重点实验室，浙江 杭州 311400）

【研究意义】植物表型是现代植物育种研究中的重要方向之一，对植物表型性状的研究有助于全面、系统地揭示树种遗传变异规律，以及植物在生长过程中对资源的分配利用和对环境的适应规律[1]。植物的表型性状是基因型对外界环境变化的适应性响应，在长期的选择压力中发生不可逆的变化，经稳定遗传后产生的[2-3]。植物表型性状中，叶片是对环境变化敏感且可塑性较大的器官[4]，叶片表型性状不仅影响植物的基本行为和光合功能，而且能反映植物对不同生境适宜能力及其与环境相互作用等信息[5-6]。【前人研究进展】植物标本承载着大量的植物信息以及生境信息，为记录生物多样性的档案，亦是人类分类调查资源研究活动的百科全书[7]。“中国数字植物标本馆”（Chinese Virtual Herbarium，简称CVH）以电子数据形式存储植物标本资料，为不同需求的用户提供标本数据查询及共享服务，使植物标本得到充分有效利用[8-9]，植物标本数据信息化也是国际上的发展趋势[10-11]，据统计仅在2006—2016 年CVH 标本资源信息支撑了17 部专著、近600 篇科研论文的发表，其科研成果主要应用于濒危物种评估、国家重点野生植物分布、中医药植物分析等多个领域[7,12]。木姜叶柯（Lithocarpus litseifolius（Hance）Chun）为壳斗科（Fagaceae）柯属（Lithocarpus）常绿乔木，其叶片含有二氢查耳酮类化合物，味甜，可代茶饮，又名甜茶。现代药理研究表明，木姜叶柯叶片二氢茶耳酮类化合物中根皮苷能抑制葡萄糖在肾脏的重吸收，进而控制血糖，干预糖尿病、肾病的发生和发展，还可促进葡萄糖的分泌、降低空腹和餐后血糖水平，而不发生低血糖副作用[13]；二氢查耳酮类化合物中根皮苷、三叶苷和根皮素能预防和改善糖尿病并发症，它们在抗糖尿病作用上受到越来越多的关注[14-15]。2017 年木姜叶柯被国家卫计委批准为新食品资源原料[16]。

【本研究切入点】木姜叶柯广泛分布于我国秦岭以南的广大亚热带地区[17]，由于其分布区生境多样，其不同地理居群间在区域尺度上产生一定形态分化，目前有文献[18]报道过广西境内的木姜叶柯叶片表型性状，在其广大分布区内叶片表型性状变异及地理分化特性尚不清楚。【拟解决的关键问题】本文通过研究国内多个植物标本馆内木姜叶柯的腊叶标本的叶片表型性状变异，揭示居群内和居群间地理变异模式，探明叶片表型性状变异及其与地理-气候因子的关系，研究结果能为种质资源收集保存评价及开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

所观测的木姜叶柯1 200余份标本来自中国科学院植物研究所标本馆（PE）、中国科学院华南植物园标本馆（IBSC）、中国科学院昆明植物研究所标本馆（KUN）、江苏省中国科学院植物研究所标本馆（NAS）、中国科学院成都生物研究所植物标本室（CDBI）、江西农业大学林学院树木标本馆（JXAU）、广西植物研究所标本馆（IBK）、四川大学生物系植物标本室（SZ）、浙江自然博物馆植物标本室（ZM）、中南林业科技大学林学院森林植物标本（CSFI）、厦门大学标本馆（AU）等。选取其中标本保存完好，采集地清楚，且采集号大于3 份的馆藏标本，共计469 份，它们分别属于62 个居群。不同居群地理气候因子见表1，其中各地经纬度信息来自GoogleEarth，气象数据来自中国气象科学数据共享服务网。

表1 木姜叶柯标本地的地理气候因子Tab.1 Geographic and climate factors of specimen collection place of L.litseifolius

续表 Continued tab.

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1.2 试验方法

利用Adobephotoshop 软件中的标尺对数字标本馆下载获得的标本图片进行叶片形态参数的测量和统计。统计的指标包括叶片长度（leaf length，LL），叶片宽度（leaf width，LW），叶面积（leaf area，LA），叶尖长度（tip length，TL），叶尖夹角（tip angle，TA），叶基夹角（base angle，BA），叶柄长度（petiole length，PL），数出一级侧脉数（primary lateral veins，PLV），并计算叶片长宽比（LL/LW）。

1.3 数据统计

用SPSS19.0软件One-way ANOVA 计算木姜叶柯居群间叶片均值、方差、变异系数，叶片表型可塑性指数（PPI）用来解释表型可塑性的特征。

式（1）中，MAX 和MIN 表示某一环境下的最大平均值和最小平均值，PPI 取值为0～1[19]，其值越大表示表型可塑性越大。用巢式方差分析计算叶片表型性状的变异来源，用Person 相关分析分析叶片各表型性状之间以及表型性状与各地理气候因子的相关系数，以各居群测定值的平均值为单元，利用样本相关矩阵进行主成分分析，并利用主成分分析的结果对各居群进行UPGMA聚类分析。

2 结果与分析

2.1 木姜叶柯叶片表型变异特征

表型可塑性大小用变异系数（CV）和表型可塑性指数（PPI）表示。对469 份木姜叶柯叶片的9 个表型性状进行统计分析（表2）。由表2 可知，木姜叶柯叶片表型性状变异范围较大，差异明显，遗传多样性丰富。一般而言，变异系数大于10%表明样本间差异较大，木姜叶柯叶片性状的平均变异系数在9.79%～42.57%，平均变异系数为22.59%，其中TL 度的变异幅度最大（42.57%），其次为PL（31.28%），TA、BA 和PLV 的变异幅度相对较小，分别为9.79%、16.87%和10.43%。计算不同居群叶片表型可塑性发现，木姜叶柯叶片性状的表型可塑性在0.50～1，TL＞PL＞LW＞LA＞LL＞LL/LW＞BA＞PLV＞TA。说明这两种表型可塑性分析方法的结果相似。在木姜叶柯表型性状中，TL 可塑性最大，TA 表型可塑性最小。

表2 木姜叶柯叶片表型性状特征Tab.2 Leaf phonotype traits characteristics of L.litseifolius

木姜叶柯数字标本叶片表型性状的各个指标居群内和居群间的差异分析见表3。由表3可知，不同居群间叶片表型性状存在着极显著的变异（P＜0.01），叶片LL、LW、LL/LW、TL、TA、BA 及LA 的变异主要来源于居群间，PL和PLV数的变异不仅来源于居群间，也来源于居群内。

2.2 木姜叶柯叶片表型性状的相关分析

对木姜叶柯9 个叶表型性状作person 相关分析（表4）。由表4 可知，叶片表型性状间存在显著或极显著的相关关系，其中叶片长与叶片宽、叶尖长度、叶面积呈极显著的正相关，与叶基夹角呈显著负相关；叶片宽与叶片长宽比呈极显著负相关，与叶面积呈极显著正相关，与叶柄长呈显著负相关；叶片长宽比与叶尖长度和叶尖夹角呈显著正相关，与叶基夹角呈极显著正相关；叶尖长度与叶基夹角呈显著负相关，与叶面积呈极显著正相关；叶尖夹角与叶脉对数呈极显著的负相关；叶基夹角与叶脉对数呈显著正相关。

进一步将叶片表型性状与标本采集地经纬度和气候因子进行相关性分析（表4）。由表4 可知，LL、LW 及LA 与采集地经度呈现极显著负相关，BA 与纬度呈极显著负相关，LL 与LA 与年降水呈显著负相关，BA 与极端最低温度呈极显著正相关，结果表明生境的地理气候因子对叶片表型性状产生一定影响。

表4 木姜叶柯叶片表型性状与地理因子的相关系数Tab.4 Correlation coefficient of leaf phonotype traits and geographic factors of L.polystachya

2.3 木姜叶柯叶片表型性状的主成分分析

对9 个叶片表型性状进行主成分分析，得到3 个特征值大于1 的主成分（表5）。由表5 可知，第一主成分与LL、LW、LA、TA 显著相关，贡献率为38.845%，第二主成分与LL/LW、BA、PLV 显著相关，贡献率为24.910%，第三主成分与PL、PLV 显著正相关，贡献率为17.699%。以上3 个主成分的累计贡献率为81.454%。

表5 木姜叶柯叶片表型性状的主成分分析Tab.5 Results of principal components analysis of leaf phonotype traits of L.polystachya

利用提取的主成分数值对62 个居群进行聚类分析（图1）。由图1 可知，62 个居群分为4 大类，其中第Ⅰ类为长披针形叶片，包括浙江、云南、湖北居群，广西金秀、凌云、隆林、上林居群，四川德昌、天全居群和江西贵溪、井冈山居群，它们叶片的特征：叶片较长，叶尖长度较大，叶柄较短；第Ⅱ类为宽披针形叶片，包括贵州各个居群，广西贺州和龙胜居群，湖南桂东、新宁、宜章居群，四川峨眉、米易居群和重庆奉节居群，它们叶片的特征：叶片长且宽，叶片长宽比较小，叶尖长度较大，叶柄较长；第Ⅲ类为长椭圆形叶片，包括福建将乐、泰宁、武夷山居群，广西凤山、靖西、那坡居群，四川叙永居群和重庆南川居群，它们叶片的特征：叶片相对较短而窄，叶片长宽比较大，叶尖长较小，叶柄较短；第Ⅳ类为宽椭圆形叶片，包括广东和海南居群以及江西、湖南南部、福建西部和广西东部且靠近广东居群，它们叶片的特征：叶片较短而宽，叶片长宽比较小，叶尖长较小而叶柄较长。

图1 不同居群木姜叶柯叶片表型性状聚类分析Fig.1 Cluster analysis result of populations based on L.polystachya leaf phenotypic trait

3 讨论

3.1 木姜叶柯叶片遗传变异丰富

植物表型性状多样性是其遗传适应性和环境异质性长期共同作用的结果，表型性状变异越丰富，越能提高其对不同环境的适应程度[20-21]。表型性状变异是遗传变异的重要组成部分，表型性状变异越大，存在的遗传变异可能越大[22]。木姜叶柯广泛分布在亚热带地区，该区域受海洋或内陆等环境和自然条件差异较大，同时作为一种雌雄同株和风媒传粉植物，其不同居群叶片表型性状上存在极大的变异，9个叶片表型性状变异系数9.79%～42.57%，且叶片表型性状遗传分化显著，表明叶片对异质生境具有较强可塑性。表型性状变异的丰富性为育种专家寻找符合生产需求的品种提供了资源的可能性。木姜叶柯是以叶片为主要利用部位的树种，不同居群叶片表型性状变异较大证实其存在丰富的遗传多样性，从中挖掘优异基因作为育种材料，将为种质资源保护、利用、创新及遗传改良提供基础。

3.2 木姜叶柯叶片表型性状与地理-气候因子的关系

通过在较大尺度上针对特定植物类群基于居群水平表型性状变异分析及研究表型性状及其与地理-气候因子间的关系，可以更准确地揭示植物表型性状的变异格局及生态响应策略[23]。木姜叶柯叶片表型性状变异呈现经纬双向变异模式，其中叶片LL、LW、LA 与经度呈极显著负相关，表现为典型的经向变异模式；叶片LL 和LA 与年降雨量呈显著负相关，表明降水是影响叶片性状的主要驱动因子；叶片BA 与纬度呈极显著负相关，与极端最低温度呈极显著正相关，证明低温是影响叶片基部性状的主导因子，即随着经度递减，降雨逐渐递减，叶片变短，叶面积递减，但随着纬度增加，极端低温越来越低，叶片基部越来越宽，以减少水分散失，提高叶片对温度和水分利用效率，从而适应复杂多变的生态环境。

3.3 木姜叶柯叶片表型性状聚类分析

广阔的分布区、多样的生境和气候的异质性，为研究木姜叶柯叶片表型性状的地理变异模式提供可能。聚类分析表明木姜叶柯按叶片表型性状提取的主成分数值可分为4个大类，从大的景观尺度来看，各居群并未严格按照地理距离而聚类，说明居群的叶表型性状变异具有不连续性；从较小的区域尺度来看，地理距离较近居群又聚为一大类。木姜叶柯叶片表型性状的聚类结果，说明生长环境的相似性是居群按照地理距离聚类的重要原因，从大的景观尺度可发现居群所生长的环境大多相对独立，环境异质性也加剧了各居群间的独立分化。木姜叶柯依靠风媒远距离传播花粉，种子结实量大，以果实为食的啮齿类动物可使种子长距离扩散，居群间基因交流距离可能大于居群间的地理距离，这显然造成了居群间基因交流较密切，使得地理距离较近居群具有相似的生态适应策略和地理变异格局。

4 结论

木姜叶柯叶片制作甜茶在我国有悠久的历史，叶片中根皮苷、三叶苷和根皮素含量高及在抗糖尿病作用使其近年受到越来越多的关注。作为在我国亚热带地区分布极广的资源树种，长期适应性进化过程中因自身遗传和外部自然地理环境等多因素综合作用，木姜叶柯叶片表型性状形成了丰富的遗传变异，在不同地理居群间出现了显著分化，且叶片表型性状变异呈现经纬双向变异模式，年降水量和极端最低温度为主要驱动因子。随着全球气候的变化，二氧化碳浓度增高、降水量及极端温度等关键驱动因子的变化可能引发木姜叶柯在适生区面积的日渐减少和分布中心的向北移动[24]。

基于腊叶标本的不同居群间木姜叶柯叶片表型性状变异较大证实其种质资源有丰富的遗传基础，但对于其叶片表型性状地理变异模式的辨析还需要实地采集更多叶片样本、全面系统地深入研究，以期为资源保护和开发利用提供理论依据。