石墨烯对杉木无性系根际土壤酶活性和微生物多样性的影响

邱静雯，章进峰，张 筱，魏永平，陈爱玲，赵建国，叶义全，，曹光球，*

（1.福建农林大学 林学院，福建 福州 350002；2.福建省永安国有林场，福建 永安 366000；3.秦岭国家植物园，陕西 西安 710404；4.国家林业草原杉木工程技术研究中心，福建 福州 350002；5.山西大同大学 炭材料研究所，山西 大同 037009）

【研究意义】杉木（Cunninghamia lanceola）是我国南方最重要的速生用材树种之一。近年来，随着木材市场对杉木材需求不断增大，杉木人工林面积不断扩大，同时对优质苗木的需求也随之增加。优质苗木不仅能够提高造林成活率，而且有利于提高苗木的抗逆性和促进其早期生长[1-2]。施肥是培育优质苗木的关键措施之一。但是不合理的施肥方式不仅增加林业生产成本，还容易导致土壤容重增加、田间持水量降低、土壤保水保肥能力下降等[3-4]，对环境产生一系列污染，甚至降低植物对养分的吸收利用效率，造成肥料严重浪费[1-2]。因此，制定科学合理的施肥措施，提高肥料利用效率成为当今林业亟待解决的技术难题之一。【前人研究进展】石墨烯是由碳原子以sp2杂化轨道构成的一种二维层状新型碳纳米材料，近年来越来越多研究表明石墨烯在促进植物种子萌发、根系生长、提高肥效等方面扮演着关键角色。张夫道等[5]研究表明，施加纳米材料可提高植物肥料利用效率，有利于提高农产品产量与改善品质。相关研究表明石墨烯会穿透种子种皮促进水分吸收[6]，促进番茄[7]、甘蓝型油菜[8]、蚕豆[9]等种子的萌发。氧化石墨烯和石墨烯可促进水稻[10]侧根发育以及小麦[11]幼苗地上部的生长。值得注意的是，近年来一些研究相继表明，石墨烯介导的植物生长调控与其对根际微生态系统结构与功能的改变密切相关[12-13]。土壤微生物是土壤生态系统中重要的组成部分，参与土壤中有机质分解、养分转化循环等诸多生态学过程[14-15]，土壤微生物代谢活动、根系分泌物及腐殖质分解和合成是土壤酶的主要来源，土壤酶活性高低表征土壤熟化程度，影响着土壤微生物多样性和群落结构组成[16]，因此土壤酶与土壤微生物均是反映土壤肥力的重要指标。蒋月喜等[17]在对朝天椒的研究中发现，在基础施肥的基础上添加适量浓度的石墨烯能够提高根际土壤酶活性，改善土壤质量，增加朝天椒产量。刘泽慧等[18]研究发现石墨烯中的含氧官能团能以电荷吸引的方式吸附土壤中的阳离子，增强土壤团聚结构并释放养分，间接为植物提供营养，促进植株生长发育。Song 等[19]研究表明石墨烯的施加提升了土壤酶活性，细菌丰度和多样性指数显著增加，且微生物多样性指数与土壤脲酶、有机质、水解氮呈一致变化。Zhang 等[20]通过探究不同浓度石墨烯对长白落叶松根际土壤理化性质及微生物多样性发现低浓度的石墨烯施加改善了长白落叶松根际土壤养分，显著影响了土壤微生物多样性和群落结构，一定浓度下石墨烯有益于植物生长发育。【本研究切入点】目前碳纳米材料主要运用在农业上，而在林业上鲜见研究报道。本课题组在前期研究中发现石墨烯与复合肥配施能够促进杉木幼苗生长、氮素吸收利用[21-22]，但这种石墨烯介导的生长促进作用是否与其对土壤酶活性和微生物多样性的改变有关则尚不清楚。【拟解决的关键问题】鉴于此，本文通过分析不同浓度石墨烯处理对杉木幼苗根际土壤酶活性及微生物多样性的影响，筛选出适合于杉木苗木施肥的最佳石墨烯浓度，从而为杉木优质苗木的高效培育提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验点概况

试验地位于福建农林大学金山校区国家林业草原杉木工程技术研究中心田间实验地大棚（26°05′N119°13′E）。试验地属亚热带季风气候，年平均温度20～25 ℃，年平均日照时数1 700～1 980 h，年平均降水量900～2 100 mm，无霜期约326 d。

1.2 材料来源

试验用苗为福建省洋口国有林场提供的1年生‘洋061’杉木无性系扦插苗，平均地径为（5.44±0.73）mm，平均苗高（29.32±3.17）cm。盆栽盆（容量为10 L，深度24 cm）为市场购买。盆栽土壤为过1 cm铁丝网筛除杂质后混合均匀的山地红心土，其化学性质为全碳（3.44±0.01）g/kg，全氮（0.44±0.01）g/kg，全磷（0.08±0.01）g/kg，全钾（5.04±0.13）g/kg。石墨烯母液由山西大同大学赵建国教授课题组提供。复合肥（N∶P2O5∶K2O=16∶16∶16）由美国瑞恩集团公司生产。

1.3 试验方法

依据课题组前期试验结果，将5 g/L 的石墨烯母液分别稀释成浓度为30，25，20 mg/L 试验添加液。试验采用完全随机区组设计，3组完全随机区组，每个完全随机区组4种处理。处理一（T1）：复合肥30 g+石墨烯30 mg/L；处理二（T2）：复合肥30 g+石墨烯25 mg/L；处理三（T3）：复合肥30 g+石墨烯20 mg/L，处理四（CK）：复合肥30 g。每盆种植1 株苗，每盆为1 个重复，区组内每个处理10 个重复；共处理120 盆。试验于2020 年5 月开始，2020 年11 月结束，共180 d。2020 年5 月15 日在苗木四周开2 cm 沟，分别施入30 g复合肥及不同浓度石墨烯添加液500 mL。培养180 d后，区组内取4株平均木，采用抖落法收集根际土壤，根际土壤样品放在干净的牛皮纸上自然阴干，研磨成粉状过0.149 nm 筛后装入自封袋后置于-80 ℃冰箱保存用于测定土壤酶活性及微生物多样性，每个测试指标测定3个重复。

1.4 测定方法

1.4.1 根际土壤酶活性分析 土壤酶活性由苏州科铭生物技术有限公司提供的微量法酶活测定试剂盒测定。

1.4.2 土壤微生物测定 采用Mobio 公司的PowerSoil DNA Isolation Kit 土壤微生物总DNA 提取试剂盒提取土壤微生物总DNA，对提取后的DNA产物经琼脂糖凝胶电泳进行检测，合格DNA稀释至1 ng/µL保存于-80 ℃。采用引物KYO2F（GATGAAGAACGYAGYRAA）和ITS4R（TCCTCCGCTTATTGATATGC）扩增真菌ITS 区；采用引物341F（CCTACGGGNGGCWGCAG）和806R（GGACTACHVGGGTATCTAAT）扩增细菌16SrRNA的V3～V4区，扩增过程参照文献[23]进行。

1.5 数据处理

采用FLASH 软件对原始数据进行质量过滤和双端序列的拼接，得到有效数据；采用Uparse 软件，将相似度≥97%的序列归为一个操作分类单元即OTU（operational taxonomic unit）并利用Greengene 数据库进行物种注释；运用Qiime 软件进行alpha 多样性指数分析；用PAST 软件进行土壤微生物与土壤环境因子RDA 典型相关分析；采用Excel 2012 软件进行数据整理；运用Origin 9 软件制图；运用SPSS 23.0 统计软件进行单因素及Person相关性分析。

2 结果与分析

2.1 石墨烯对杉木无性系根际土壤酶活性的影响

脲酶、谷氨酰胺酶、硝酸还原酶及亚硝酸还原酶均是与氮代谢有关的酶，是影响土壤氮素水平的重要因子。由图1 可知，T3 处理土壤脲酶活性比对照提高6.87%，而T1、T2 分别比对照降低29.84%、9.22%，T1 处理显著低于T3、CK（P＜0.05）；T2、T3 处理硝酸还原酶活性比对照提高39.16%、59.32%，T1 降低34.79%，整体表现为T3＞T2＞CK＞T1，4 种处理均达到显著性差异（P＜0.05）；T3 亚硝酸还原酶活性与对照相比提高2.65%，而T1、T2 分别降低14.44%、1.69%，但4 种处理之间差异不显著；T3 处理谷氨酰胺酶比对照提高11.75%，T1、T2处理与对照相比分别降低3.9%、11.45%，T3显著大于T2（P＜0.05），由此可知，当石墨烯浓度为20 mg/L 时，4 种酶活性最高且均高于对照组，随着石墨烯浓度增加，其对土壤酶活性抑制作用增强，整体呈现低促高抑的变化规律。

图1 不同浓度石墨烯处理对根际土壤酶活性的影响Fig.1 Effects of different concentrations of graphene on enzyme activities in rhizosphere soil

2.2 石墨烯对土壤微生物群落多样性的影响

去除掉低质量的序列，得到的细菌样本有效序列共1 391 114条，真菌样本有效序列共1 393 737条，样本测序覆盖度均达到90%以上，表明该处理下主要优势微生物得到分析，数据满足后续的数值分析。

不同浓度石墨烯处理微生物多样性指数见表1。Coverage 指数在不同处理之间均为0.99，说明样本测序深度高，测序结果可信度高。Simpson 和Shannon 指数综合体现物种的变化程度，细菌的Shannon、Simpson指数在不同浓度处理与对照之间差异不显著，真菌T3、T2处理分别比对照提高18.39%、11.53%，而T1 降低了14.75%，大小排序为：T3＞T2＞CK＞T1，与对照差异显著。Chao1、Ace 指数主要反映样本的物种丰富度信息，是估计物种总数的指标，数值越大，表示样本中物种多样性越高，在细菌中T1、T2、T3 分别比对照提高0.02%、11.29%、10.26%，除T1外，与对照差异显著，真菌T2、T3处理下Chao1与Ace指数与对照差异显著，均在石墨烯浓度为20 mg/L时，多样性指数最高。综上所述，当石墨烯浓度为20 mg/L时，根际土壤微生物多样性指数达到最大，相较细菌多样性而言，石墨烯对真菌多样性的影响更加显著。

表1 根际土壤微生物多样性指数Tab.1 Microbial diversity index of rhizosphere soil

2.3 根际土壤微生物多样性与土壤酶活性相关关系

由表2 可知，硝酸还原酶与细菌中Chao1 和Ace 指数呈极显著相关。在真菌多样性指数中脲酶与Shannon 指数呈显著正相关，硝酸还原酶与Shannon、Simpson 指数呈显著极显著正相关，与Chao1 指数呈显著相关，谷氨酰胺酶与Shannon、Simpson指数呈显著相关。

表2 根际土壤微生物群落多样性指数与土壤酶活相关性分析Tab.2 Correlation analysis between rhizosphere soil microbial community diversity index and soil enzyme activity

采用RDA（Redundancy analysis）冗余分析对环境因子、样本之间进行研究，环境因子与细菌与真菌群落组成在相关分析见图2、3，箭头表示环境因子，排序轴与箭头连线夹角表示环境因子与排序轴的相关性，夹角越小表明关系越密切，而箭头连线表示环境因子与研究对象相关程度的大小，箭头越长表示环境因子对样本分布的影响越大，如图2 所示，第一主坐标轴对土壤细菌变化解释达86.80%，第二主坐标轴对土壤细菌变化解释达9.45%，共解释了细菌96.25%的变异。如图3 所示，第一主坐标轴对土壤真菌变化解释达57.27%，第二主坐标轴对土壤真菌变化解释达27.64%，共解释了真菌84.91%的变异。因此，硝酸还原酶是微生物多样性变化的主要因子，且均与T3样本关系密切。

图2 土壤细菌群落RDA分析Fig.2 RDA analysis map of soil bacterial community

图3 土壤真菌群落RDA分析Fig.3 RDA analysis map of soil fungal community

3 讨论

3.1 石墨烯对杉木幼苗根际土壤酶活性的影响

土壤酶作为土壤生态系统中重要的组成部分，对土壤的能量转换和物质循环起着重要的作用，通常是衡量外来物质对土壤生物活性影响的重要指标之一[24]。石墨烯作为一种新型的碳纳米材料，具有较大的比表面积、易溶于水等特点，对土壤中的养分离子有较强的吸附性，能减少土壤因降水、灌溉导致的淋溶损失，具有保肥作用[25]。试验中添加20 mg/L石墨烯处理有利于脲酶活性提升，这与段成伟等[26]发现低浓度的石墨烯能够增加东北暗棕壤的脲酶活性研究结果相似。脲酶能够促进尿素水解NH4+，成为植物可以利用的有效氮[27]，是土壤微生物氮源的重要来源，对促进土壤氮素循环有重要意义。以往研究报道，脲酶活性与微生物数量、有机质含量呈正相关，碳源的加入可促进土壤中微生物活性，继而提升脲酶活性[25]。因此推测石墨烯的施用活化了土壤的肥力与养分，为土壤微生物的生存提供了有利的环境，从而导致了脲酶活性的增加。谷氨酰胺酶是控制氮代谢的酶，其活性的提高既可以增强氮代谢运转，又可以促进氨基酸的合成[28]，氨基酸可作为氮源在微生物代谢过程中转化为植物生长调节剂以促进植物生长[1]。本研究中20 mg/L 石墨烯处理下谷氨酰胺酶活性提升，但3 种石墨烯处理均与对照差异不显著，说明土壤谷氨酰胺酶活性对石墨烯浓度响应不敏感。硝酸还原酶、亚硝酸还原酶是土壤反硝化过程中2种重要的反硝化酶，其活性表征土壤反硝化能力。本试验中20 mg/L 浓度石墨烯处理下2 种反硝化酶均高于对照组，其中硝酸还原酶达显著性差异，这与相关研究报道石墨烯溶液能够提高朝天椒根区土壤硝酸还原酶活性[17]研究结果相似。硝酸还原酶是催化NO-

3转化为NO-2的专性酶，其活性主要受土壤温度、pH、有机质的影响[27]，杨士等[29]研究表明生物炭负载氧化石墨烯能够提升土壤中的pH 值，蒋月喜[17]等研究表明石墨烯能够提高土壤中的有机质含量，对土壤pH 有一定的调节作用，有机质能够激活土壤中硝酸还原酶的活性[30]，这可能是本研究中硝酸还原酶活性增加的原因。土壤亚硝酸还原酶主要作用是催化NO-2还原成NH2OH，为将NH2OH催化还原为植物可吸收的氮素（NH4+）的反应提供充足的反应底物[31]，一方面20 mg/L石墨烯处理促使硝酸还原酶活性的提高，充足的NO-2有利于亚硝酸还原酶催化反应的进行，另一方面反硝化酶的生成主要受反硝化微生物的调控[30]，适宜浓度的石墨烯可能有利于某些反硝化微生物的生存，因此提高了亚硝酸还原酶的活性。上述结果表明，20 mg/L 的石墨烯在一定程度上可促进土壤脲酶、谷氨酰胺酶、硝酸还原酶、亚硝酸还原酶活性，提高杉木幼苗对氮素的吸收利用。

3.2 石墨烯对杉木幼苗根际土壤微生物多样性的影响

外源石墨烯可以进入生物细胞，释放金属离子，吸附污染物，间接或直接地对土壤微生物产生影响[32-33]，土壤中的微生物分解、释放土壤中的营养元素向植物迁移，继而影响植物生长，已有研究相继证实了这一点[17,34]。本研究结果表现为微生物多样性随着石墨烯浓度的增加呈先升高后降低的变化规律，20 mg/L，25 mg/L石墨烯显著提升了真菌的丰富度及常见物种的优势度，20 mg/L石墨烯处理下土壤微生物多样性指数达到最高。土壤微生物多样性影响土壤生态系统的结构和功能，与土壤养分之间相互作用，维持稳定的土壤微生物多样性，能够提高林地生产力，增强抗病原菌的能力，有利于植物生长发育[35]。Rong 等[36]将石墨烯及其氧化物施加在4 种不同类型土壤中发现土壤微生物多样性得到提升。Du等[37]报道石墨烯不仅提升了土壤中细菌的种类和多样性，并且使一些固氮的细菌在属水平上富集。Ru等[38]研究表明氧化石墨烯通过影响土壤的关键性质（土壤pH、有机质、脲酶）提升微生物多样性。因此推测土壤理化性质和酶活性的改变可能是本试验土壤微生物多样性提升的原因之一。但值得注意的是，随着浓度的提高，4种酶活性和微生物多样性反而降低，当浓度达到30 mg/L，酶活性甚至低于对照组，说明石墨烯对土壤酶活与微生物多样性促进作用存在浓度效应。多数研究也表明，过量的纳米材料的添加会对土壤产生毒害，这可能是本研究酶活与微生物多样性在30 mg/L 时显现下降的原因。此外，相关性及RDA分析指出，脲酶与硝酸还原酶与微生物多样性指数呈显著或极显著正相关，有研究表明参与土壤碳氮循环的微生物对纳米材料较敏感，可能由于石墨烯的添加有利于某些参与碳氮循环的微生物生存，使土壤酶活性与微生物多样性变化趋势一致，但影响机制较复杂，还需进一步研究。

4 结论

20 mg/L 浓度石墨烯提升了杉木幼苗根际土壤脲酶、谷氨酰胺酶、硝酸还原酶及亚硝酸还原酶活性分别较对照提高了2.65%～59.32%，其中尤以硝酸还原酶活性提升最为显著。20 mg/L，25 mg/L 浓度石墨烯提升了土壤微生物多样性，较细菌多样性而言，石墨烯对真菌多样性的影响更加显著，脲酶与硝酸还原酶与微生物多样性指数呈显著或极显著正相关。

综合土壤酶活性和微生物多样性指标，本研究条件下20 mg/L 石墨烯浓度是适合杉木优良无性系洋061 生长的最佳浓度。该处理下通过提高杉木幼苗根际土壤参与氮代谢相关的酶活性和土壤微生物群落多样性，促进养分的周转，提高植物对养分的吸收利用，从而最终促进植物的生长。本结论也印证了课题组在前期研究得到20 mg/L，25 mg/L 石墨烯能够利于杉木幼苗养分积累、根系生长及氮素吸收利用[21-22]的结果。