丛枝菌根真菌对植被混凝土中黄花决明生长和抗旱性的影响

张 洋 郭士维 舒 倩 夏 栋 涂璇 许文年,4

(1.三峡大学 生物与制药学院,湖北 宜昌 443002;2.三峡大学 土木与建筑学院,湖北 宜昌 443002;3.三峡大学 水利与环境学院,湖北 宜昌 443002;4.水泥基生态修复技术湖北省工程研究中心,湖北 宜昌 443002)

利用植被混凝土进行边坡生态修复,可同时满足工程防护及边坡绿化需求,适用于高陡、硬质及受冲刷坡体[1],在国内工程领域得到广泛应用.关于植被混凝土的研究目前主要包括利用功能菌提高土壤肥力[2]、外加掺料对基材及植物的影响[3]等方面.关于利用微生物提高植被混凝土植物抗旱性研究较少.在植被混凝土护坡初期,高陡的地形会形成地表径流,加之基材蒸散效应,易使植物处于干旱胁迫环境[4];同时在干旱半干旱地区应用时,存在年降水量少、取水难、气候干燥、蒸发强烈等问题,使得植物由于缺水而无法良好的生长[5].近年来许多学者利用微生物的手段来提高植物抗旱性[6-7],能否将微生物技术引入边坡修复中以对抗工程上出现的干旱问题是目前研究的重点.

丛枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi,AMF)作为土壤中广泛分布的内生菌根真菌,可与绝大多数陆生植物根系形成共生结构[8].AMF 通过根外菌丝直接吸收土壤水分[9]、强化渗透调节能力、降低植物氧化损伤[10]、调节酶活性及诱导相关基因表达[11-12]等机制提高植物抗旱性,降低干旱对植物的造成损伤,因此出现越来越多关于利用AMF 提高矿区[7]、荒漠化地区[6]等干旱生态系统中植物的抗旱性研究.摩西斗管囊霉(Funneliformis mosseae,FM)、根内根孢囊霉(Rhizophagus intraradices,RI)在多种土壤类型中广泛分布,更容易侵染植物根系[13].有研究表明接种FM 和RI有效促进石漠化生境中白枪杆的生长和光合作用[6].

黄花决明(Cassia sulfurea Lam.)由于其根系发达,保土蓄水能力强,可作为水土保持植物在矿山、铁路基等贫瘠条件下生长[14],常用于植被混凝土边坡生态修复中.然而,关于干旱条件下AMF 对生长于植被混凝土中黄花决明生长、抗旱性的影响,仍是菌根技术应用的关键科学问题.因此,本研究通过对干旱胁迫下的黄花决明接种不同AMF菌剂,分析植被混凝土中黄花决明植株生长、抗氧化酶活性和渗透调节物质等指标的变化,并通过主成分分析法对黄花决明抗旱性进行综合评价,筛选出最优接种方式,为AMF运用到植被混凝土生态边坡修复提供参考.

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试植物:挑选外观均匀一致黄花决明种子,使用5%NaCl O 消毒,无菌水冲洗,浸泡24 h.

供试菌种:摩西斗管囊霉(FM,编号:BGC XJ07A)和根内根孢囊霉(RI,编号:BGC BJ09)由青岛农业大学菌根生物技术研究所提供,菌剂包含孢子(20～30个/g)、根段、菌丝和扩繁基质.

培养基质:植被混凝土基材按照植被混凝土生态防护技术规程要求配制[1].基质基本养分状况为:p H8.0,有机质13.7 g/kg,全氮0.86 g/kg,全磷0.84 g/kg.

1.2 试验设计

采用双因素(基材水分×AMF)完全随机试验.按土壤含水率/田间最大持水量设置正常水分(WW,70±5%)、中度干旱(MD,50±5%)、重度干旱(SD,35±5%)3个水分梯度;单接种RI、单接种FM 和对照组CK(添加同等质量的高温灭菌菌剂)3种接种方式,每个处理设3个重复,共有27盆.将配置好的植被混凝土基材阳光下暴晒消毒,在75%酒精擦拭消毒后的花盆(规格:19.5 cm×16 cm×14 cm)中分两层混合装盆;基层约10 cm,不含黄花决明种子、AMF菌剂;面层约2 cm,含黄花决明种子、AMF 菌剂60 g(其中FM、RI各30 g,单接种时一种AMF做灭菌处理).播种后正常浇水养护30 d,之后开始不同程度干旱处理.用WET 水分测定仪测定基材水分,并用称重法控制基材含水量,每2～5 d对花盆进行浇灌补水,以维持设定的水分条件.干旱30 d后进行各项指标的测定.干旱处理30 d后黄花决明状态如图1所示.试验于湖北省宜昌市三峡大学土木与建筑学院前塑料温室内进行.

图1 干旱30 d后植物生长状态

1.3 指标测定

1.3.1 生长指标测定

每盆选取3株长势相当的植株,每个处理测定9个植株,测量株高,分离地上与地下部分,用根系扫描仪测定根长,测定完成后于105℃烘箱杀青30 min,再于75℃烘干48 h,准确称取植株总生物量.

1.3.2 抗氧化酶活性和渗透调节物质测定

每盆选取3株长势相当的植株,每个处理测定9个重复,选取中上部完全伸展的叶片测量.采用紫外吸收法测定过氧化氢酶(CAT)活性,氮蓝四唑法测定超氧化物歧化酶(SOD)活性;硫代巴比妥酸法测定丙二醛(MDA)含量;茚三酮比色法测定脯氨酸(Pro)含量;蒽酮法测定可溶性糖(SS)含量;考马斯亮蓝染色法测定可溶性蛋白(SP)含量[15].

1.4 数据处理

数据以平均值±标准差表示.使用Microsoft Excel 2016和SPSS 20.0 对数据进行整理、统计分析.采用单因素方差分析(One-way ANOVA),不同处理下各指标内的差异.双因素方差(Two-way ANOVA)检验交互作用(α=0.05).Pearson法分析各指标间的相关性,采用主成分分析法分析不同处理下黄花决明抗旱性.使用Origin 2022绘图.

2 结果与分析

2.1 AMF对干旱胁迫下黄花决明生长指标的影响

由表1可知,相同干旱程度下,接种AMF 均能够提高黄花决明根长和总生物量,且对总生物量作用显著,相较于CK 组,接种AMF 对黄花决明根长和总生物量分别提高7.5%～36.7%和10.6%～29.5%,其中各干旱程度下接种RI对根长和总生物量的促进作用最大,但重度干旱下对根长的作用除外,FM 促进作用大于RI.两种接种方式下,CK 组黄花决明株高均为最大值.各干旱程度下接种AMF对株高都存在一定程度的抑制作用,其中在重度干旱下对株高的抑制程度最低,接种RI降低2.7%,接种FM 降低2.6%.

表1 干旱胁迫下接种AMF对黄花决明生长指标的影响

双因素方差分析表明,干旱胁迫和AMF 接种方式对根长、生物量和株高均有极显著影响,但两者的交互作用仅对根长有显著影响(见表2).

表2 显著性检验

2.2 AMF对干旱胁迫下黄花决明抗氧化性的影响

相同干旱程度下接种AMF 显著提高SOD 活性,与CK组相比,SOD活性在接种RI时提高97.2%、105.2%和136.5%,接种FM 时提高39.5%、25.7%和42.7%.重度干旱程度下接种FM 时CAT 活性较高于CK 组,其余组在相同干旱程度下对CAT 活性均有显著提高,其中接种RI时CAT 活性分别提高78.9%、100.9%和111.6%,接 种FM 时CAT 活 性分别提高31.1%、31.9%和19.3%,以上结果表明接种RI对提高抗氧化酶活性作用最大.在相同接种方式下SOD 和CAT 活性随干旱胁迫程度的加深而降低(图2).双因素方差分析表明,干旱胁迫和AMF接种方式对SOD 和CAT 活性有独立的极显著影响.

除正常水分下接种FM 组外,其它组与CK 组相比,接种AMF 均显著降低MDA 含量.接种RI组MDA 含量分别降低18.5%、33.7%和34.3%,接种FM 组MDA 含量分别降低4.2%、21.3%和20.8%,结果表明接种RI更有利于减少叶片内MDA 含量(如图2所示).干旱胁迫,接种方式及干旱胁迫与接种方式的交互作用对MDA 含量均有显著影响.

图2 干旱胁迫下接种AMF对黄花决明抗氧化性的影响

2.3 AMF对干旱胁迫下黄花决明渗透调节物质的影响

如图3所示,随着干旱胁迫程度的加深,SS含量不断增加,重度干旱下FM 组的SS 含量最高,为35.97 mg·g-1.接种RI组SS含量分别增加5.4%、41.8%和19.5%,接种FM 组SS 含量分别增加11.2%、49.5%和29.6%,结果表明干旱胁迫下接种AMF能显著增加SS含量,且在中度干旱下接种FM效果最显著.在正常水分下接种AMF对Pro含量的作用不显著;在中度和重度干旱下,接种AMF 的黄花决明Pro含量显著低于CK 组,且RI组作用效果显著高于FM 组.SP 含量随干旱胁迫程度的加深不断降低,在正常水分下FM 组黄花决明SP 含量最高,为1.74 mg·g-1.各干旱胁迫下,FM 组与CK 组存在显著差异,RI组仅在重度干旱下对叶片中SP含量存在显著作用.双因素方差分析表明,干旱胁迫和接种方式及两者的交互作用对渗透调节物质的含量均具有极显著影响.

图3 干旱胁迫下接种AMF对渗透调节物质的影响

2.4 不同处理方式下黄花决明的抗旱性评价

2.4.1 干旱胁迫下黄花决明生长生理指标的相关性分析

为了解黄花决明各生长生理指标间的关联度,对生长、抗氧化酶活性和渗透调节物质等9个指标进行相关性分析,如图4所示.

图4 黄花决明生长、抗旱性指标相关性热图

发现大部分指标间相关性达到显著或极显著水平,尤其是总生物量与所有指标均显著相关,直接用这些指标进行抗旱性综合评价,存在指标间信息重叠的问题,难以客观评价,因此,本研究采用主成分分析法对干旱胁迫下接种AMF 对黄花决明抗旱性的影响进行综合评价分析.

2.4.2 干旱胁迫下黄花决明生长生理指标的主成分分析

对不同处理方式下黄花决明生长生理指标进行主成分分析(PCA),提取特征值大于1的主成分特征值及方差贡献率,解释不同处理对黄花决明生长生理指标的影响(见表3).本研究提取2个主成分,累计贡献率为81.5%.其中第1主成分(PC1)的贡献率为63.7%,第2主成分(PC2)的贡献率为17.8%.

表3 各指标主成分分析的特征值于方差贡献率

由图5可知,不同干旱胁迫分布区域明显,表明干旱胁迫程度在影响黄花决明生长生理特性方面存在显著差异.各指标因子载荷反映各指标对主成分的影响,因子载荷越大,在对应主成分中的权重也越大.与PC1相关性较大的指标有8 个,其中总生物量、CAT、SP、SOD 和株高与PC1正相关,SS、Pro、MDA与PC1负相关;与PC2相关性较大的指标有6个,其中SS、SOD、CAT 和根长与PC2正相关,SP 和株高与PC2负相关.综上说明干旱胁迫下,可以将黄花决明生长、抗氧化酶活和渗透调节物质等指标作为评价黄花决明抗旱性的主要作用因子.

图5 不同处理下黄花决明生长、抗旱性指标的主成分分析

2.4.3 黄花决明抗旱性综合评价

根据主成分得分系数矩阵和标准化的数据分别计算出主成分1(F1)、主成分2(F2)的表达式,再以表中的主成分1、主成分2的贡献率与累计贡献率的比值作为权重,计算得出主成分的综合得分F.F1、F2和F表达式如下:

根据上述公式对不同处理的黄花决明抗旱性进行综合评价(见表4),综合得分F值越高,黄花决明的抗旱性越强.

表4 不同处理方式下黄花决明抗旱性综合评价

由表4得,不同处理下黄花决明抗旱性由强到弱依次为:A2>A3>B2>A1>C2>B3>B1>C3>C1.干旱胁迫下,RI组和FM 组的综合排名均大于CK组,说明接种RI和FM 的黄花决明抗旱性高于CK组,接种AMF能够提高黄花决明抗旱性;同时,RI组黄花决明抗旱性明显高于FM 组,表明在植被混凝土中接种RI更有利于提高黄花决明的抗旱性.

3 讨论

本试验中,接种AMF均能增加黄花决明的根长和生物量,原因可能是接种AMF 能扩大根系接触面积,改善根系在干旱条件下对水分的吸收,提高植物吸收N、P等养分含量,进而促进根长和生物量的增加[7,16].具体而言,与接种FM 相比,接种RI在促进黄花决明根长和生物量方面效果更显著,可能是因为相较其他AMF而言,RI具有更高的土壤水分吸收效率,更能促进植物的生长[17].本试验中接种AMF 对植物株高有一定的抑制作用,这与前人研究不同,造成这种现象形成的原因可能是干旱条件下AMF 在形成共生结构时需消耗植物光合作用产物,从而调节植株同化物分配,致使植物通过减少地上部分株高来提升根系长度,因而株高会受到抑制[18].

干旱胁迫下植物细胞结构因活性氧(ROS)过度累积而破坏,因而受到严重的氧化损伤[15].大量研究表明,接种AMF 会提高植物抗氧化酶活性,增强清除ROS的能力,从而降低ROS对植物的损伤[19-21].本试验中,SOD 和CAT 的活性随干旱胁迫的加深而降低;同一干旱胁迫下,接种AMF 的黄花决明SOD和CAT 活性较CK 组相比均有显著提高.已有研究证实,AMF 通过上调干旱胁迫下植物叶片超氧化物歧化酶基因(Pt Fe-SOD,Pt Mn-SOD)和过氧化氢酶基因(PtCAT)的相对表达量,促进寄主植物抗氧化酶SOD,CAT 基因的表达[22],使菌根植物具有更强的抗氧化能力.MDA 作为植物氧化损伤产物,可以在干旱胁迫下指示植物受氧化损伤的程度[22].本试验中,MDA 含量与SOD、CAT 活性负相关,接种AMF后黄花决明的MDA 含量明显低于CK 组,表明AMF能够保护植物免受ROS损伤,其中RI的作用效果显著高于FM,可能是由于不同种属AMF 对植物有不同的适应性[23],RI在植被混凝土中对黄花决明的适应性大于FM.以上结果证实在干旱胁迫下AMF对寄主植物的保护作用.

应用于干旱半干旱地区的植被混凝土技术,会使植物处于干旱和弱碱性胁迫的双重作用下,因此,植物会通过积累渗透调节物质Pro、SS和SP等含量增加细胞质浓度,提高细胞渗透压,缓解胁迫造成的损伤[24].研究表明,接种AMF的黄花决明叶片中SS含量明显高于未接种,说明AMF可优化干旱环境下植物的糖代谢水平,增强植物绳头调节能力[12,25].本试验中SS含量随干旱胁迫程度的加深而不断增加,与CK 组相比,接种AMF 显著提高SS含量.Pro是干旱胁迫下决定蛋白质和膜结构以及清除ROS的重要游离氨基酸[26],可以调节细胞内渗透势和氧化还原反应.AMF在正常水分下对Pro作用并不明显,在中度和重度干旱下Pro含量显著低于CK 组,这与Wu等[27]在枳、Ahmed等[28]在金合欢上的研究结果相一致.Zou等[29]研究发现,干旱胁迫下接种AMF 抑制植物Pro合成,同时促进Pro降解,导致Pro积累较少,但对植物的生长性能和生物量存在促进作用.由此得出结论,在植被混凝土中接种AMF植物能够以较少的脯氨酸含量减轻干旱胁迫造成的损伤.有研究证实,干旱胁迫下接种FM 和隐类球囊霉(Paraglomus occultum)能显著增加枳(Citrus trifoliata)叶片中蔗糖、葡萄糖、果糖的含量[27].AMF 通过miRNA下调编码蛋白的相应靶基因,进而参与植物叶片和根组织的干旱胁迫反应[30].本实验中,接种FM 组提高SP含量的作用效果大于RI,可能是由于植被混凝土处于弱碱性状态,FM 在弱碱性土壤中分布优于RI[31],因此可以更好的作用于黄花决明提高SP含量.

本研究利用主成分分析法对不同AMF 接种方式对黄花决明抗旱性进行综合评价,结果表明在不同干旱胁迫下接种RI对于提高黄花决明抗旱性效果均高于FM,该结果与田方等[32]利用AMF提高白刺花抗旱性的研究结果一致.

4 结论

干旱胁迫限制黄花决明的生长,降低叶片中抗氧化酶活性,导致氧化损伤产物MDA 含量升高,SS和Pro含量的积累随干旱的加重而增加,但SP 含量有所降低.接种AMF显著提高干旱胁迫下黄花决明的根长和总生物量,一定程度上缓解干旱胁迫对植物的抑制作用,但对株高作用不明显;AMF在黄花决明根系上定殖后通过提高植物SOD、CAT 活性,降低MDA 含量增强抗氧化能力,同时通过增加SS和SP含量,降低Pro含量,提高植物渗透势以此来提高黄花决明抗旱性.利用主成分分析对不同处理下黄花决明抗旱性进行综合评价结果表明,相同干旱程度下接种AMF黄花决明抗旱性排名均为:RI>FM>CK,说明RI对黄花决明抗旱性的促进作用效果优于FM.综上所述,RI更适合应用于植被混凝土边坡植被恢复中.