精草铵膦绿色生物合成技术及应用前景

董怡

(永农生物科学有限公司，浙江 绍兴 312300)

精草铵膦又称L-草铵膦，是拜耳从吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)发酵液中分离得到具有杀菌活性的三肽化合物——双丙氨膦(bialaphos)，由2 分子L-丙氨酸和一种当时未知的氨基酸构成[1]。精草铵膦(L-草铵膦)属于膦酸类除草剂，其作用机制和草铵膦相同。草铵膦是D/L-草铵膦的外消旋物，仅L-草铵膦具有除草活性[2]，通过作用于植物体谷氨酰胺合成酶，抑制L-谷氨酰胺合成，导致细胞毒剂铵离子累积、铵代谢紊乱、氨基酸缺失、叶绿素解体、光合作用被抑制，最终将杂草彻底杀死[3]。

除草剂销售榜首草甘膦[4]的长期广泛使用已导致牛筋草、小飞蓬、田旋花等杂草抗性的发生、发展。2015 年，草甘膦被国际癌症研究列为可能的人类致癌物，慢性动物饲养研究也发现可导致肝脏和肾脏肿瘤发病率增加[5]，种种致癌风波使法、德等国家禁用草甘膦。因此，草铵膦市场进一步增量，其销售额从2012 年4.5 亿美元增至2020 年10.50 亿美元，成为增长最快的非选择性除草剂。

相较于传统草铵膦，精草铵膦活性是其2 倍以上。永农生物科学有限公司2018 年在国内登记了精草铵膦的原药和制剂，精草铵膦的推广能够降低50%施药量，即每使用1 t 精草铵膦相当于直接向农田减排1 t D-草铵膦无效体，有效减轻农田耕作对环境造成的负担[6]，符合国家农药减量增效政策。

1 精草铵膦化学合成现状

L-草铵膦制备方法主要有3 种：不对称合成法[7-9]、外消旋体拆分法[10-12]和生物催化法。工业化大规模生产方法主要是不对称合成法和外消旋体拆分法[13]。

不对称合成法是从手性原料出发合成光学纯L-草铵膦。2007 年，明治制果将β-次膦酸酯基醛与伯胺反应生成亚胺类化合物，在Jacobsen 催化下，用三甲基硅氰对亚胺进行不对称Strecker 反应(图1)，再经水解转化得到精草铵膦，e.e.值最高达94%[14]。此工艺较复杂，需要使用昂贵的手性拆分试剂，理论收率仅50%，单次拆分率低[15]。

图1 不对称Strecker 反应合成L-草铵膦工艺路线

外消旋体拆分法是通过对外消旋DL-草铵膦或其衍生物进行手性拆分，实现D 型和L 型异构体分离，从而得到光学纯L-草铵膦。2018 年史泰龙等[16]报道了以Pseudomonassp.zjut126 为催化剂、N-癸酰草铵膦为拆分底物水解拆分制备L-草铵膦的合成工艺路线。拆分过程中N-癸酰草铵膦在Pseudomonassp.zjut126 催化下，L-N-癸酰草铵膦水解生成L-草铵膦(图2)，而(D)-N-癸酰草铵膦不参与反应，处理后可得e.e.值大于95.2%的L-草铵膦。此工艺步骤多、收率低、手性原料昂贵，不利于大规模制备。

图2 用Pseudomonas sp.zjut126 细胞拆分外消旋草铵膦制L-草铵膦工艺流程

2 精草铵膦生物合成

生物催化具有立体选择性严格、反应条件温和、收率高等优点，具有替代传统化学合成潜力。传统生物催化法主要包括：⑴以L-草铵膦衍生物为底物，通过酶法直接水解获得，但前体昂贵且不易得；⑵以外消旋草铵膦前体为底物，通过酶选择性拆分获得，理论收率仅50%，造成原料浪费。此外，以DL-草铵膦为原料的去消旋合成法优势明显，由于当前市售的草铵膦主要为DL-草铵膦，其工业化生产技术成熟，去消旋合成法以DL-草铵膦为原料，原料易得，且成本较低，能够较好地对接现有草铵膦工业生产体系。

2.1 草铵膦脱氢酶突变体去消旋合成L-草铵膦

浙江工业大学薛亚平教授团队[17]发现了一种由野生菌Thiopseudomonas denitrificans中草铵膦脱氢酶V377S 位点突变所得的突变体。以DL-草铵膦为原料，D-草铵膦在D-氨基酸氧化酶催化下形成2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸，L-草铵膦因不参与反应而被完全保留；产物2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸通过草铵膦脱氢酶突变体催化还原为L-草铵膦。该方法是对当前去消旋合成法的升级，草铵膦脱氢酶突变体具有更好催化效率，以外消旋DL-草铵膦为底物进行催化反应时，转化率远高于野生型酶，PPO 产率也大幅提升。

2.2 ω-转氨酶去消旋合成L-草铵膦

2021 年浙江大学杨立荣教授团队[18]公开了一种全新生物酶——ω-转氨酶，来自芽孢杆菌(Bacillussp.)YM‑01，用于去消旋化生产L-草铵膦，能够避免有毒物质过氧化氢生成。以DL-草铵膦为原料，通过R-选择性的ω-转氨酶将D-草铵膦转化为2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸，L-型草铵膦由于不参与反应而得以保留；然后谷氨酸脱氢酶以2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸为原料不对称合成L-草铵膦，从而得到光学纯L-型草铵膦(图3)，并使用醇脱氢酶进行辅酶再生，同时生成丙酮作为第一步转氨酶的氨基受体，最大幅度提高了原料利用率。合成过程中所需辅原料异丙醇转化为副产物异丙胺，经过简单蒸馏回收为农药化工原料。

图3 全新生物酶法去消旋化合成L-草铵膦的工艺流程

2.3 多酶级联生物催化生产L-草铵膦

上述2 种去消旋合成法相对传统生物合成法均具有一定突破，但在大规模工业生产中仍具有其局限性。利用D-氨基酸氧化酶将D-草铵膦氧化为2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸的过程中会产生过氧化氢，易导致酶蛋白失活，尽管理论上可以通过添加过氧化氢酶的方式将其去除，但在实际工业生产中并不能完全消除其不利影响，并且过氧化氢酶的使用会增加过程成本。ω-转氨酶去消旋合成L-草铵膦的生物合成路线虽然能够避免催化过程中过氧化氢的产生，但其后续的生物不对称合成反应大多为可逆反应，因此存在酶利用效率低、L-草铵膦收率低等问题[17-18]。

2022 年，中国石油和化学工业联合会组织专家召开了“手性纯草铵膦(精草铵膦)除草剂绿色生物制造技术与应用”科技成果鉴定会。该成果由永农生物联合华东理工大学生物催化与生物合成领域专家魏东芝教授团队共同开发，借助魏东芝教授团队20 多年在酶工程与生物催化方面的技术优势以及永农生物在草铵膦生产与应用方面的经验积累，开发了多酶级联生物催化生产L-草铵膦新工艺，创新了高活性、高对映选择性酶定制技术和多酶自组装生物催化技术，创建了高底物浓度、纯水反应体系，通过生物催化技术，实现将DL-草铵膦近100%效率转化为L-草铵膦，是生物制造生产农药品种的成功范例。该项目建成国际首条生物技术可实现年产5 000 t L-草铵膦生产线，在全球范围内首次实现L-草铵膦绿色生物制造工艺产业化。大规模生物法制造L-草铵膦属国际首创，有力推动了产业升级，经济和社会效益显著[19]。

3 展望

1995 年，拜耳、先正达等巨头开始推广抗草铵膦以及多抗转基因作物[20]，1996 年转基因作物商业化种植，2018 年全球26 个国家和地区种植了转基因作物，种植面积超1.9 亿hm2，其中大豆是最大抗除草剂转基因作物，玉米其次。2020 年草铵膦转基因作物需求为1.2 万t，在草铵膦总需求中占比26%。目前草铵膦已成为仅次于草甘膦的第二大转基因作物耐受除草剂，主要需求在单抗草铵膦种子(主要为巴斯夫的耐草铵膦油菜种子和耐草铵膦大豆种子)以及大豆、棉花、玉米的双抗/三抗种子。此外，全球草铵膦抗性基因已经导入水稻、小麦、甜菜、烟草、大豆、棉花、番茄、玉米、油菜、甘蔗等20 多种作物中，商业化程度大幅提升。预计2025 年，转基因作物需求将达3.4 万t，占比36%，草铵膦全球需求量也将达6.76 万t[21]。当前抗草铵膦转基因作物商业化程度提升，草铵膦需求结构性改善。相较于传统草铵膦，精草铵膦活性倍增、用量减半，其可以代替传统灭生性除草剂草甘膦、百草枯，也同样适用于耐草铵膦转基因作物，精草铵膦正处于快速发展期，市场前景广阔。