胃癌中LAMP5 表达及预后意义分析

张 翔，周 宏，周云海

（无锡市第二人民医院普外科，江苏 214001）

胃癌是常见的恶性肿瘤,2020年全球新发胃癌约110 万例,患者病亡约80 万例[1-2]。近年来尽管针对HER2、微卫星不稳定性（MSI）和程序性死亡配体1（PD-L1）等的靶向治疗取得一定进展,但总体5年生存率仍低于20%[3-4]。溶酶体相关膜蛋白5（lysosome-associated membrane protein 5,LAMP5）是分子量为31.7 kDa 跨膜蛋白,包含4 个保守半胱氨酸的管腔结构域和1 个跨膜结构域[5]。既往研究表明,LAMP5 高表达与白血病患者预后不良有关,敲除LAMP5 可通过激活自噬促进癌症相关蛋白降解,降低肿瘤细胞体内存活率[6]。LAMP5 与浆细胞样树突状细胞的增殖及机体免疫耐受有关,对肿瘤的发生和进展至关重要[5]。预后模型分析提示LAMP5 与胃癌及结肠癌患者的预后相关[7-8]。本研究收集2015年1月—2017年12月我院病理科确诊的130 例胃癌手术石蜡标本,采用组织芯片免疫组化检测胃癌组织中LAMP5 蛋白表达,分析LAMP5 蛋白表达与患者临床病理特征及预后的关系。同时利用TCGA 数据库及GEPIA 数据库,分析胃癌组织LAMP5 mRNA 表达水平与患者临床病理参数及总体生存期（OS）的关系,使用基于标准化RNA-Seq 数据的基因富集分析研究LAMP5 可能的作用通路。

1 材料与方法

1.1 组织标本 手术切除的胃癌组织130 例及其邻近正常组织石蜡标本40 例,制作成组织芯片。患者术前均未接受放、化疗。收集患者年龄、性别、肿瘤分级、肿瘤分期、肿瘤大小、淋巴结转移、远处转移和总体生存时间等临床病理信息。本研究经医院伦理委员会批准,患者均签署知情同意书。

1.2 免疫组化染色及判读标准 采用EnVision 法,操作步骤参照试剂盒说明书。切片经梯度酒精和二甲苯脱蜡后,在压力锅中用柠檬酸抗原修复缓冲液（pH 6.0）修复20 min,然后滴加内源性过氧化物酶阻断剂孵育20 min,加一抗LAMP5 抗体（1 ∶200 稀释）（Proteintech,武汉）继续孵育60 min,随后用辣根过氧化物酶偶联的二抗覆盖切片,3,3'-二氨基联苯胺染色,最后苏木素复染,显微镜下观察。LAMP5 蛋白表达判读标准[9]：LAMP5 蛋白定位于细胞质,呈现棕黄色,按染色强度阴性、弱阳、中等和强阳分别计0、1、2 和3 分。染色阳性细胞百分比0～25%、26%～50%、51%～75%和76%～100%分别计1、2、3 和4 分。染色评分=染色强度计分×染色范围计分,≥6 分为高表达,＜6 分为低表达。每张切片由两名高年资病理医师独立判读打分,意见不一致时共同商议后统一。

1.3 数据库分析 从The Cancer Genome Atlas（TCGA）（https：//portal.gdc.cancer.gov/）数据库下载375例胃癌和32 例正常胃样本的基因表达谱和临床数据[10],分析胃癌组织LAMP5 mRNA 表达水平及其与患者临床病理参数及总体生存期（overall survival,OS）的关系。利用基因表达谱交互分析（Gene Expression Profiling Interactive Analysis,GEPIA）数据库,分析LAMP5 表达与胃癌患者OS 及无病生存期（disease free survival,DFS）的关系。使用基于标准化RNA-Seq 数据的基因集富集分析（gene set enrichment analysis,GSEA）研究LAMP5 可能的作用通路,并以gene ontology（GO）和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）注释[11]。FDR＜0.25 和P＜0.05 为具有统计学意义。

1.4 统计学处理 组织芯片样本数据应用SPSS 20.0 统计学软件进行分析,LAMP5 表达与患者临床病理特征的关系采用χ2检验,Kaplan-Meier（K-M）生存曲线分析LAMP5 表达与胃癌患者OS 的关系。TCGA 数据使用R 语言3.6.3 和Strawberry Perl 软件处理,Kruskal-Wallis 检验分析LAMP5 表达与肿瘤分级、分期、大小和淋巴结转移之间的关系,Wilcox检验分析LAMP5 表达与远处转移的相关性。采用单因素和多因素COX 回归分析评估LAMP5 的预后价值。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 组织芯片分析 与邻近正常胃组织相比,胃癌组织中LAMP5 蛋白表达水平明显升高（图1A-C）。根据染色评分,将130 例胃癌患者分为LAMP5 高表达组61 例和低表达组69 例,比较两组临床病理特征的差异。结果显示,LAMP5 蛋白表达与肿瘤分期（S）（P=0.045）、肿瘤大小（T）（P=0.006）相关,与年龄、性别、肿瘤分级（G）、淋巴结转移（N）及远处转移（M）无关（P＞0.05）。见表1。K-M 生存曲线分析表明,LAMP5 蛋白表达水平与胃癌患者OS 呈负相关（P=0.035）,图1D。

表1 两组胃癌患者临床病理特征比较 例

图1 胃癌组织LAMP5 蛋白表达及患者总生存期分析

2.2 TCGA 数据验证LAMP5 在胃癌中的表达及其与患者临床病理特征的关系 与正常胃组织相比,LAMP5 mRNA 在胃癌组织中表达增高,差异有统计学意义（P=0.016）（图2A）。Kruskal-Wallis 检验表明,LAMP5 mRNA 表达水平与肿瘤分级GⅢ/GⅠ（P=0.024）、GⅢ/GⅡ（P＜0.001）（图2B）,分期SⅡ/Ⅰ（P＜0.001）、SⅢ/Ⅰ（P＜0.001）、SⅣ/Ⅰ（P＜0.001）（图2C）,肿瘤大小T2/T1（P=0.002）、T3/T1（P＜0.001）、T4/T1（P＜0.001）、T3/T2（P=0.026）及T4/T2（P=0.005）（图2D）相关,与淋巴结转移（N）和远处转移无关（M）（图2E-G）。

图2 TCGA 数据验证LAMP5 mRNA 在胃癌中的表达及其与临床病理特征的关系

2.3 验证LAMP5 与胃癌患者预后的关系 为进一步明确LAMP5 表达与胃癌患者预后的关系,首先通过调查GEPIA 数据库发现LAMP5 表达与胃癌患者OS（P=0.013）（图3A）及DFS（P=0.049）负相关（图3B）。随后,TCGA 数据K-M 生存曲线分析表明,LAMP5 表达越高,胃癌患者OS 越短,预后越差（P=0.007）（图3C）。TCGA 数据单因素COX 回归分析表明,年龄（P=0.006）、分期（S）（P＜0.001）、肿瘤大小（T）（P=0.032）、淋巴结转移（N）（P=0.006）、远处转移（M）（P=0.024）和LAMP5 表达（P=0.004）可作为胃癌患者的预后指标。多因素COX 回归分析表明年龄（P＜0.001）、性别（P=0.047）和LAMP5 表达（P＜0.001）可作为胃癌患者预后的独立指标,见表2。

图3 数据库分析LAMP5 表达与胃癌患者预后的关系

表2 胃癌患者预后的单因素及多因素COX 回归分析

2.4 GSEA 富集分析 为了阐明胃癌中LAMP5 可能的生物学功能,我们进行GSEA 富集分析,并用GO 和KEGG 进行注释。基于归一化富集分数（nor malized enrichment score,NSE）的绝对值|NSE| ＞1,我们选择5 个最相关的信号通路。GO 分析显示,LAMP5 可能参与促进胶原结合、细胞外基质结构成分、糖胺聚糖结合、生长因子结合、整合素结合途径等通路,抑制呼吸作用、线粒体呼吸链复合物组件、呼吸电子传输链、NADH 脱氢酶复合物组件、核糖体结构成分等通路（图4A）。KEGG 分析表明,LAMP5可能促进ECM 受体相互作用、焦点粘附、TGF-β 信号通路、Hedgehog 信号通路、癌症途径等通路,抑制阿尔茨海默病、氧化磷酸化、亨廷顿病、帕金森病、核糖体等通路（图4B）。

图4 GSEA 富集分析

3 讨 论

研究表明,LAMP5 与典型溶酶体相关膜蛋白LAMP1 和LAMP2 具有序列和结构的同源性,在大多数生命体神经组织中表达[12-13],缺失LAMP5 的中间神经元会导致阿尔茨海默病患者神经元网络功能障碍[14]。LAMP5 在白血病非活化树突状细胞和原始树突状细胞肿瘤中表达,促进肿瘤进展[15]。敲除LAMP5 能通过激活自噬和抑制上皮间质转化（EMT）相关基因功能,抑制胃癌细胞的增殖、侵袭和迁移,促进胃癌细胞凋亡和细胞周期停滞[4]。

本研究通过组织芯片免疫组化和TCGA 数据分析,证实LAMP5 在胃癌组织中高表达,LAMP5 表达越高,患者预后越差,单因素和多因素COX 回归分析表明LAMP5 可作为胃癌患者预后的独立指标。此外,我们还发现LAMP5 表达与肿瘤分期和大小正相关,但未能证明LAMP5 与胃癌淋巴结转移及远处转移相关,这与有关研究并不一致,可能是由于本研究样本量不足所致。

本研究通过GSEA 富集分析,发现胃癌中LAMP5 表达与ECM 受体、焦点粘附、胶原结合、细胞外基质结构成分、糖胺聚糖结合和整合素结合途径等与细胞黏附相关的通路正相关。细胞黏附过程伴随着信号传递和基因表达的调控,对维持机体内稳态起着重要作用[16-17]。肿瘤细胞通过增强细胞黏附将外界信号传递到细胞内,从而改变细胞肌动蛋白重组、迁移、基因表达等行为[18]。因此,我们推测细胞黏附相关信号通路的激活在LAMP5 促进胃癌进展过程中发挥重要作用。本研究还发现LAMP5 表达与氧化磷酸化和氨基酸代谢等通路负相关。细胞内氧化磷酸化被抑制时,肿瘤细胞可通过促进糖酵解获得能量,其结果是产生更多的乳酸。乳酸经单羧酸转运蛋白和碳酸酐酶修饰,酸化细胞外环境,进一步促进癌细胞扩散[19],推测LAMP5 可以通过调节肿瘤细胞代谢促进胃癌进展。此外,本研究显示LAMP5 还与TGF-β 和Hedgehog 等信号通路正相关。以往研究发现,在肿瘤后期TGF-β 通路通过促进EMT、刺激血管生成和诱导免疫耐受等途径促进肿瘤进展[20],而Hedgehog 信号通路激活时会增强肿瘤转化、进展、转移和耐药性等生物学行为[21]。

综上所述,本研究发现LAMP5 在胃癌组织中表达增高,LAMP5 表达与肿瘤分期、大小正相关,与胃癌患者OS 负相关,LAMP5 可作为胃癌患者预后的独立预测指标。LAMP5 促进胃癌发生及进展与细胞黏附及代谢等通路有关。