miR-29a-3p 抑制非小细胞肺癌增殖和迁移

朱 俊，姜 云，徐莹莹，刘 剑

（南通大学附属医院1 心胸外科；2 肿瘤化疗科，江苏 226001）

肺癌是发病率和致死率较高的恶性肿瘤之一,非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）占全部肺癌的80%～85%[1]。尽管NSCLC 综合治疗（包括手术、放化疗、免疫治疗和靶向治疗等）取得较快进展,但患者5年总体生存率仍然很低[2-3]。进一步探究NSCLC 生物学机制,寻找新的治疗靶点具有重要意义。MicroRNA（miRNA）是一类小而短的非编码单链RNA,由19～25 个核苷酸组成,通过直接与mRNA 的3'-UTR 区域结合抑制mRNA 表达[4-5]。肿瘤组织中绝大多数miRNA 是肿瘤抑制因子,但普遍受到抑制[6]。miRNA 表达水平与患者临床参数及预后密切相关,可作为肿瘤诊断及预后的生物标志物[7]。有研究显示,miR-383-5p 能显著抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭,可作为乳腺癌预后指标和抗肿瘤抑制剂[8]。低表达miR-335-5p、miR-155-5p、miR-146a-5p 和miR-124-3p 胃癌患者的分期更晚,肿瘤分化更差,淋巴结转移和脉管浸润率更高,预后更差[9]。miR-29a-3p 在淋巴细胞白血病患者血清及细胞株中表达降低,通过靶向肝癌衍生生长因子（HDGF）抑制肿瘤细胞增殖、促进凋亡[10]。肾透明细胞癌中miR-29a-3p 通过下调KDM5B 的表达,抑制肿瘤细胞增殖和侵袭[11]。本研究对12 例NSCLC 手术切除癌组织及癌旁正常组织进行miR-29a-3p 表达检测,研究NSCLC 中miR-29a-3p 的表达及其对NSCLC 发生、进展的作用。

1 材料与方法

1.1 组织标本 选择2022年1月—3月我院胸外科行手术切除的12 例NSCLC 患者,均经术后病理证实,临床分期Ⅱ～Ⅲ,其中3 例发生淋巴结转移,术前均未进行放化疗。取癌组织及距肿瘤边缘约2 cm的正常组织。本研究获南通大学附属医院伦理委员会批准,患者均签署知情同意书。

1.2 细胞培养与转染 正常支气管上皮细胞株BEAS-2B 及NSCLC 细胞株H1299 和A549（中国科学院细胞库）用含10%胎牛血清（FBS）（Gibco,美国）的RPMI-1640 培养液（Gibco,美国）在37 ℃、5%CO2条件下培养。细胞长满后用胰酶消化,按5×105/孔加入6 孔板,待细胞密度达80%时,根据Lipo8000TM转染试剂（碧云天,中国）说明书操作步骤转染阴性对照（NC）和miR-29a-3p mimics,继续培养24 h 后进行后续实验。

1.3 RNA 提取和RT-qPCR 检测 采用Trizol 试剂（Invitrogen,USA）提取组织和细胞中总RNA,取1 μL RNA 样品,One Drop 2000 超微量分光光度计测定RNA 纯度及浓度。miRNA 加Poly（A）尾后,将1 μg总RNA 反转录为cDNA,反应程序42 ℃、50 min,85 ℃、5 min。最后,采用miRNA 荧光定量PCR 检测试剂盒（康为,中国）进行RT-qPCR,反应条件：预变性95 ℃、10 min,变性95 ℃、15 s,退火/延伸60 ℃、1 min,重复40 个循环。以U6 作为内参。miR-29a-3p 引物序列：上游5'-TGCGGACTGATTTCTTTTGG-3';下游5'-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3'。U6 引物序列：上游5'-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3';下游5'-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3'。采用2-ΔΔCt法计算miR-29a-3p 相对表达量。

1.4 CCK-8 细胞增殖活力检测 H1299 和A549 细胞转染后以每孔1×104个接种于96 孔板,于37 ℃、5%CO2条件下分别培养24 h、48 h、72 h 和96 h。根据CCK-8 试剂说明书（碧云天,中国）操作,弃去培养基,加入CCK8 试剂,37 °C 孵育1 h,于酶标仪450 nm 处测量吸光度。

1.5 EdU 细胞增殖实验 依照BeyoClickTMEdU 试剂盒（碧云天,中国）说明书操作,H1299 和A549 细胞转染后与50 μmol/L EdU 溶液在37 °C 下孵育2 h,4%多聚甲醛固定15 min,0.2%Triton X-100 通透10 min,在避光条件下分别用点击反应液和Hoechst 染料孵育30 min。荧光显微镜（Olympus,日本）观察并拍照,Image J 软件计数。

1.6 划痕实验 H1299 和A549 细胞转染后继续培养24 h,用200 μL 移液器吸头在6 孔板底部垂直划线,显微镜下观察并拍照。随后加入含2% FBS 培养基,于37 ℃、5%CO2继续培养,24 h 后显微镜下观察并拍照。使用Image J 软件分别计算划痕的愈合面积。

1.7 数据库分析 我们在miRDB、RNA22、TarBase、TargetScan 4 个数据库中分别预测miR-29a-3p 的靶基因,将这些靶基因作韦恩图取交集,然后进行Gene Ontology（GO）富集分析,探究miR-29a-3p 可能的作用通路。

1.8 统计学处理 应用GraphPad Prism 5 统计学软件进行数据分析及作图。计量资料以±s表示,配对资料采用配对t 检验,两组间差异性比较采用t 检验,三组间差异性比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 NSCLC 组织及细胞中miR-29a-3p 低表达 RTqPCR 检测显示,与正常肺组织相比,NSCLC 组织中miR-29a-3p 表达水平显著降低（P＜0.05）,见图1A。H1299 和A549 细胞中miR-29a-3p 的表达水平显著低于正常支气管上皮细胞BEAS-2B（P＜0.05）,见图1B。

图1 miR-29a-3p 在NSCLC 组织及细胞中的表达

2.2 miR-29a-3p 抑制NSCLC 细胞增殖 H1299 和A549 细胞分别转染NC 和miR-29a-3p mimics 后,RT-qPCR 检测显示,miR-29a-3p mimics 组较NC组miR-29a-3p 的表达量显著增高（P＜0.01）,见图2A,说明转染成功。CCK8 实验表明,miR-29a-3p mimics 组H1299 和A549 细胞的增殖活力明显下降（P＜0.01）,见图2B-2C。EDU 实验也表明miR-29a-3p mimics 组H1299 和A549 细胞的增殖能力降低（P＜0.05）,见图2D。

图2 过表达miR-29a-3p 对NSCLC 细胞增殖的影响

2.3 miR-29a-3p 抑制NSCLC 细胞迁移 划痕实验结果显示,与NC 组相比,miR-29a-3p mimics 组H1299 和A549 细胞的伤口愈合面积均显著降低（P＜0.05）,见图3A-B。

图3 划痕实验结果

2.4 miR-29a-3p 靶基因的GO 富集分析 GO 富集分析显示,miR-29a-3p 靶基因主要富集在细胞外基质结构成分、胶原结合、含有细胞外基质的胶原蛋白、内质网腔、外部封装结构组织、细胞外结构组织、细胞外基质组织、多肽赖氨酸修饰等相关通路,见图4。

图4 预测miR-29a-3p 靶基因及GO 富集分析

3 讨 论

既往研究发现,miRNA 在肿瘤细胞增殖、凋亡、转移和肿瘤血管生成等过程中发挥重要作用,miRNA 表达模式与肿瘤类型、分期和转移等临床病理参数密切相关[12]。miR-451a 在NSCLC 组织和细胞系中下调,miR-451a 通过靶向调节ATF2,抑制NSCLC细胞迁移和侵袭[13];miR-485-5p 在NSCLC 中的表达下调,NSCLC 过表达可通过靶向RRM2 抑制肿瘤细胞增殖和迁移,增强顺铂的敏感性[14]。因此越来越多的研究致力于探索miRNA 作为NSCLC 生物标志物和治疗靶点的价值[15]。

miR-29a-3p 在许多肿瘤发展过程中具有重要作用,如食管癌中miR-29a-3p 通过靶向VEGFA/CDC42/PAK1 信号通路抑制肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭[5];肝细胞癌中miR-29a-3p 通过靶向IGF1R 抑制肿瘤细胞增殖和迁移[16];甲状腺癌中miR-29a-3p通过靶向OTUB2 抑制NF-κB 信号传导,抑制肿瘤细胞生长、增殖和侵袭[17]。本研究发现NSCLC 组织及细胞系中miR-29a-3p 低表达,miR-29a-3p 能抑制NSCLC 细胞的增殖和迁移。富集分析显示miR-29a-3p 与细胞外基质结构成分、胶原结合、含有细胞外基质的胶原蛋白、内质网腔、外部封装结构组织,细胞外结构组织,细胞外基质组织、多肽赖氨酸修饰等相关通路密切相关。既往研究发现,人支气管上皮细胞中miR-29a-3p 通过抑制SPARC/ERK 信号通路抑制上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）,最终抑制细胞迁移[18],因此推测miR-29a-3p 抑制NSCLC 细胞迁移可能与EMT有关。

总之,本研究表明miR-29a-3p 是NSCLC 抑制因子,能抑制NSCLC 细胞增殖和迁移,其分子信号通路有待于进一步深入研究。miR-29a-3p 可能通过调节细胞外基质成分抑制NSCLC 细胞迁移。