EphB3 受体在乳腺癌中的表达及临床意义

黄均慧，王 峰，王 华

（1 南通大学医学院，江苏 226001；南通大学附属医院2 甲乳外科，3 检验科）

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤,发病率仍在不断上升[1-2]。促红细胞生成素产生肝细胞激酶（erythropoietin producing hepatocytekinase,Eph）受体是受体酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase,RTK）家族的最大亚类,Eph 受体及其Ephrin 配体参与人类多种肿瘤的发生和发展[3]。已有研究表明,EphB3 在非小细胞肺癌、结直肠癌和卵巢粘液性癌等肿瘤中异常表达[4-6]。本研究收集2015—2016年南通大学附属医院甲乳外科80 例乳腺癌患者的手术标本,测定乳腺癌组织及其癌旁组织中EphB3 受体表达水平,分析EphB3 受体与乳腺癌临床病理学参数以及预后的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 女性乳腺癌患者80 例,均行乳腺癌改良根治手术,术前未接受过其他抗肿瘤治疗,经病理证实为原发性肿瘤。手术切取乳腺癌组织及其周围5 cm 处正常组织,随即置于-80 °C 冰箱保存待测。本研究经过南通大学附属医院伦理委员会批准,患者签署知情同意书。

1.2 RNA 提取和浓度测定 组织标本置于冰上,每例标本约取50 mg,剪碎后放入EP 管中,加入1 mL Trizol 试剂（Invitrogen 公司,美国）和3 颗研磨珠,研磨机（KZ-III-F）研磨后移至新EP 管中,进行瞬时离心。加入0.2 mL 三氯甲烷,震荡混匀后在4 ℃、12 000 r/min 离心15 min。取最上层透明液体0.5 mL移至新EP 管中。加0.5 mL 异丙醇沉淀RNA,离心,保留白色胶状沉淀。加入1 mL 75%酒精洗涤,再次4 ℃、7 500 r/min 离心10 min,留下白色沉淀。置于50 ℃烘箱中15 min,使白色沉淀变为透明。加入20 μL DEPC 水,再次于60 ℃烘箱中5 min,获得RNA 原液。采用紫外线光谱仪测定RNA 浓度,置于-80 ℃冰箱中保存。

1.3 逆转录 提取的RNA 置于冰上,依照逆转录试剂盒说明书依次添加各种试剂。采用C1000 基因扩增仪,25 °C 300 s,42 °C 3 600 s,70 °C 300 s,4°C至结束。结束后加入DEPC 水,将逆转录的cDNA 稀释6 倍,震荡摇匀后放入-80 °C 冰箱中保存。

1.4 实时荧光定量PCR 依次向八连管中加入荧光染料10 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、反转录产物cDNA 8 μL,以U6 作为内参,每例样本设置3 个复孔。采用Cobas z 480 型全自动荧光PCR 分析仪（罗氏公司,瑞士）,反应设置：95 °C 10 min,95 °C 15 s,60 °C 30 s,72 °C 30 s,循环45 次。结束后以2-△△CT值计算EphB3 相对表达水平。EphB3 及U6 引物序列按相关文献获得[7-8],U6 上游引物：5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3',U6 下游引物：5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3';EphB3上游引物：5'-GGC CATAGCCTATCGGAAGT-3',EphB3 下游引物：5'-TCCCAGTAGGGTCGCTCTC-3'。所用引物由上海生工生物工程公司合成。

1.5 病理参数 患者病理参数包括年龄、肿瘤直径、淋巴结转移、组织学分级、TNM 分期、雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）、Ki67、人表皮生长因子受体-2（HER-2）表达、分子分型和病理类型。乳腺癌组织学分级分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级[9],按第八版乳腺癌AJCC分期体系作为TNM 分期依据[10]。Ki67 表达＞20%为阳性[11];三阴性乳腺癌定义为ER、PR 和HER-2 均阴性的乳腺癌;HER-2 阳性定义为免疫组织化学结果为3+或ISH 检测阳性。原位癌包括导管内癌和小叶原位癌。

1.6 统计学处理 应用SPSS 26.0 和GraphPad-Prism 8.0 软件进行数据分析和图片绘制。计量资料以±s表示,组间比较采用t 检验和方差分析;计数资料以频数和率表示,组间比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 EphB3受体在乳腺癌组织和癌旁正常组织中的表达 EphB3 受体在乳腺癌组织中的表达水平高于对应癌旁正常组织,差异具有统计学意义（P＜0.001）。见图1。

图1 EphB3 受体在乳腺癌组织和癌旁正常组织中的表达

2.2 EphB3 受体表达与临床病理参数的关系 EphB3受体在乳腺癌中的表达与患者年龄、肿瘤直径、TNM分期、ER、PR、HER-2、Ki67 表达及分子分型无相关性（P＞0.05）,与淋巴结转移、组织学分级及病理类型有关（P＜0.05）。见表1。

表1 EphB3 表达与临床病理参数的关系 例

2.3 EphB3 受体表达与乳腺癌患者预后的关系 患者术后出院通过电话和门诊随访60 个月,复发或转移26 例,无复发转移54 例。Kaplan-Meier 生存曲线分析显示,乳腺癌组织EphB3 高表达患者无进展生存期较低表达患者更短（P=0.019）,差异有统计学意义。见图2。

图2 Kaplan-Meier 生存曲线

2.4 影响无进展生存期相关因素 采用Cox 比例风险回归模型进行单因素和多因素分析,结果显示,EphB3 受体高表达、HER-2 阳性、分子分型三阴性以及淋巴结转移是影响乳腺癌患者无进展生存期的独立危险因素（P＜0.05）。见表2。

表2 乳腺癌无进展生存期影响因素分析

3 讨 论

乳腺癌为高度异质性恶性肿瘤,个体化治疗尤为重要[12]。Eph 受体家族通过受体与配体、适配器蛋白和触发下游信号通路的相互作用产生影响,不公影响肿瘤的发生发展,而且为新的癌症靶向策略提供基础[13]。在非小细胞肺癌中EphB3 受体以一种不依靠激酶的通路促进肿瘤细胞增殖、转移和种植,可能成为治疗非小细胞肺癌的有效治疗靶点。

本研究结果显示,乳腺癌组织EphB3 受体表达水平显著高于对应癌旁正常组织,差异具有统计学意义（P＜0.01）,提示EphB3 受体在乳腺癌中发挥促瘤作用,有望成为乳腺癌新的治疗靶点。文献报道,EphB3 受体在结直肠癌和卵巢浆液性癌中的表达显著降低,其过表达预示患者更好的预后[4-6],这与本研究结果矛盾,说明EphB3 受体在癌症发生发展中的作用依赖于肿瘤类型。

EphB3 受体与多种人类癌症的进展和预后有关。本研究结果显示,EphB3 受体表达与乳腺癌组织学分级、淋巴结转移及病理类型密切相关,组织学分级越高、发生淋巴结转移和病理类型为浸润性癌的患者EphB3 受体表达越高。EphB3 受体高表达患者无进展生存期显著缩短,Cox 比例风险回归模型表明EphB3 受体高表达、HER-2 阳性、分子分型三阴性以及发生淋巴结转移是乳腺癌不良预后的独立危险因子。与预期相反的是,本研究中不同TNM 分期和分子分型乳腺癌中EphB3 受体表达无显著差异,这可能与样本量小有关。

综上所述,EphB3 受体在乳腺癌组织中表达水平明显增高,EphB3 受体高表达是影响乳腺癌患者预后的独立危险因素。本文为回顾性研究,患者临床分期较好,大部分为浸润性癌,少部分为原位癌,不同手术方法和术后辅助治疗可能影响患者预后,需要进一步研究。今后应增大样本量,开展细胞实验,分析EphB3 受体对乳腺癌细胞转移和增殖的作用,进一步探索EphB3 受体促进乳腺癌进展的分子机制。