一链双靶siRNA 对皮肤鳞状细胞癌NET-1和Survivin 基因表达及增殖和凋亡的影响研究*

季周婧，张丽丽，张 捷

（南通大学附属医院皮肤科，江苏 226001）

皮肤鳞状细胞癌是一种常见的皮肤恶性肿瘤,发病率目前在世界范围内呈上升趋势[1],其发病机理、预防和治疗是研究热点[2]。siRNA（small interfering RNA）是一种短片段双链RNA 分子,能以同源互补序列的mRNA 为靶目标降解特定mRNA,导致相应基因沉默。NET-1 属于四聚体超家族（tetraspanin superfamily）（TM4SF）成员之一,其表达与多种肿瘤的过度增殖有关[3-4]。本课题组前期研究发现,靶向NET-1 的siRNA 真核表达载体能有效下调NET-1 基因表达,抑制A431 皮肤鳞癌细胞的增殖、迁移和浸润,提示NET-1 可能在A431 细胞增殖、迁移、侵袭过程的信号传递中起关键作用[5-6]。Survivin属于凋亡抑制蛋白（IAP）家族新成员,是近年来新发现的凋亡抑制基因[7]。本课题组前期研究显示,在皮肤鳞癌形成和发展中促增殖基因NET-1 和抗凋亡基因Survivin 起重要作用,抑制此两种基因可起到协同抗肿瘤作用。本研究构建一组同时靶向NET-1和Survivin 基因的一链双靶siRNA,通过脂质体介导转染A431 细胞,研究一链双靶siRNA 对皮肤鳞癌细胞株NET-1 和Survivin 基因的抑制作用以及对细胞增殖、凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞株 人皮肤鳞癌细胞株A431 由西安第四军医大学西京医院全军皮肤病研究所高天文教授惠赠。

1.2 构建一链双靶siRNA 在已经筛选确定的单靶siRNA 序列基础上,根据siRNA 优化原理,将NET-1 基因siRNA 靶点序列和Survivin 基因siRNA靶点序列进行排列组合,设计一条一链双靶siRNA序列,其中正义链为连续的长链RNA,反义链为不连续的2 条短链RNA。NET-1 和Survivin siRNA 由百奥迈科生物技术有限公司协助设计与合成。经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,合成的siRNA 质量佳。siRNA 序列见表1。

表1 siRNA 序列

1.3 细胞培养及转染 将A431 细胞接种于DMEM培养液（美国Invitrogen 公司）中,内含10%小牛血清（FCS）、100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 链霉素,置于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养。待细胞贴壁后更换细胞培养液,细胞长满培养瓶90%以上进行传代。转染前1 d 将对数生长期A431 细胞以2×105个/mL密度接种于6 孔板（Nunc 公司）,待细胞生长汇合达到70%时,参照Lipofectamine 2000 转染试剂（美国Invitrogen 公司）操作说明以50 nmol/L 终浓度加入细胞中进行转染。共分为5 组：第一组转染一链双靶siRNA,第二组转染NET-1 siRNA,第三组转染Survivin siRNA,第四组转染NC siRNA,第五组为未转染组（空白对照组）。于37 ℃、5%CO2细胞培养箱内培养48 h,荧光显微镜（Olympus BXn）检测细胞转染效率。

1.4 细胞免疫共沉淀 将对数生长期A431 细胞以2×105个/mL 密度接种于6 孔板,细胞汇合度达到90%时加入RIPA 细胞裂解液（含PMSF 蛋白酶抑制剂）,冰上裂解30 min,12 000 r/min 离心30 min 后取上清。取少量上清液用于检测蛋白表达,其余上清液分成两管,一管加入1 μg NET-1 抗体和30 μL protein A -beads,另一管不加抗体作为对照,4 °C 缓慢摇晃孵育过夜。免疫沉淀反应后,4°C 下3 000 r/min离心15 min,将protein A -beads 离心至管底;小心吸去上清,protein A-beads 用裂解缓冲液洗3 次;加入15 μL 2×SDS 加样缓冲液,沸水煮10 min。采用Western blot 法检测蛋白表达,蛋白经电泳、转膜、封闭后,加入鼠抗人Survivin 抗体（1∶200）一抗4 ℃孵育过夜,洗去一抗后,加入兔抗鼠IgG 抗体（1∶2 000）二抗室温孵育2 h,ECL 化学发光显影。反向免疫共沉淀操作同上,用Survivin 抗体代替上面的NET-1抗体,Western blot 法检测蛋白表达时以NET-1 抗体为一抗,羊抗兔IgG 抗体为二抗。

1.5 qRT-PCR 检测基因表达 细胞转染48 h 后收获细胞,TRIzol 法提取各组细胞总RNA,以mRNA为模板,oligo dT 为引物,逆转录合成cDNA。逆转录反应条件为42 ℃30 min,Real-time PCR 反应体系：2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL,green I 0.5 μL,P1（10 μmol/L）0.5 μL,P2（10 μmol/L）0.5 μL,模板4 μL,DEPC 水7 μL。反应条件：95 ℃预变性5 min;95 ℃变性20 s,58 ℃退火20 s,72 ℃延伸30 s,40 个循环。引物序列见表2。

表2 qRT-PCR 引物序列

1.6 Western blot 法检测细胞蛋白表达 细胞转染48 h 后加入细胞裂解液,冰上裂解30 min,12 000 r/min离心15 min,取上清,BCA 法检测细胞总蛋白浓度。将40 μg 蛋白质与相应体积的2×上样缓冲液混合,煮沸5 min 后上样,进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳结束后采用半干转印仪（Bio-Rad公司）将蛋白从凝胶中转移至PVDF 膜（美国Pharmacia 公司）,5%脱脂牛奶室温封闭2 h,分别加入兔抗人NET-1 抗体（1∶200）和鼠抗人Survivin 抗体（1∶200）,4 ℃孵育过夜。洗去一抗后,加辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG 抗体（1∶1 000）和兔抗鼠IgG抗体（1∶2 000）室温孵育2 h。ECL 化学发光显影,以β-actin 作为内参。

1.7 CCK-8 法检测细胞增殖活力 取对数生长期A431 细胞,0.25%胰蛋白酶消化后,调整细胞浓度为1×104个/孔接种于96 孔培养板中。分为5 组,设3个时间点（24 h、48 h、72 h）,每个时间点作3 个复孔。每孔加入100 μL 培养液,37 ℃、5%CO2下培养,次日进行瞬时转染,于转染后24 h、48 h、72 h 进行CCK-8 检测。将10 μL CCK-8 和100 μL DMEM 培养液（不含小牛血清）混合后加入各孔,放入培养箱培养2 h,酶标仪测定各孔吸光值。

1.8 流式细胞仪检测细胞凋亡 收集转染48 h 后细胞,制备单细胞悬液,调整细胞浓度约1×106个/mL,取1 mL 细胞悬液用0.01 mol/L PBS 洗涤2 次,2 000 r/min 离心5 min,弃上清。将细胞重悬于500 μL Binding Buffer 中,先后加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI,室温避光反应5 min,立即上流式细胞仪（FACSCallibur,美国BD 公司）检测。

1.9 细胞免疫荧光检测NET-1、Survivin 蛋白在细胞内的表达 取对数生长期细胞以1×105个/mL 密度接种于铺有载玻片的6 孔板,待细胞生长汇合达到70%时,同前分组进行转染。转染后48 h 以4%中性甲醛于4 ℃下固定细胞2 h,1%Trition 破膜30 min,1%BSA 室温封闭2 h,加一抗（1∶50）4 ℃过夜。PBS洗3 遍后加入TRITC 和FITC 标记的荧光二抗（1∶200）,避光室温孵育2 h,Hochest（1∶1 000）避光染色30 min,缓冲甘油封片。激光共聚焦显微镜下观察拍照,用于TRITC 激发波长为550 nm,FITC 激发波长为495 nm,Hochest 激发波长为353.6 nm,计数各组表达NET-1和Survivin 阳性细胞。

1.10 统计学处理 应用SPSS 17.0 统计学软件对数据进行分析处理。计量资料以±s表示,组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）,多组间比较采用方差分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 细胞免疫共沉淀证实NET-1 和Survivin 在A431 细胞中的相互作用 用鼠抗人Survivin 抗体和A431 细胞总蛋白进行免疫共沉淀,免疫复合物电泳转膜后用兔抗人NET-1 抗体进行免疫印迹分析。结果表明,Western blot 检测到免疫复合物中含NET-1 蛋白,证明NET-1 和Survivin 存在相互作用,免疫印迹中出现的条带与细胞总蛋白条带一致（图1a）,反向免疫共沉淀Western blot 也同样检测到免疫复合物中含Survivin 蛋白（图1b）,证实A431细胞中NET-1 和Survivin 存在相互作用。

图1 A431 细胞中NET-1 和Survivin 蛋白表达

2.2 单靶和一链双靶siRNA 转染后A431 细胞中NET-1 和Survivin mRNA 和蛋白的表达 A431 细胞转染各组siRNA 48 h 后,荧光显微镜检测细胞转染效率达到80%。与siRNA-NC 组和control 组比较,转染NET-1 siRNA 组细胞中NET-1 mRNA 水平降低57%,蛋白水平降低54%（图2,图3）,表明靶向NET-1 的siRNA 能有效下调NET-1 基因表达。同样,与control 组比较,转染Survivin siRNA 组细胞中Survivin mRNA 水平降低52%,蛋白水平降低58%（图2,图3）。有趣的是,我们发现转染NET-1 siRNA 组细胞中Survivin mRNA 水平降低11%（图2）,蛋白水平降低27%（图3）,转染Survivin siRNA组细胞中NET-1 mRNA 水平降低19%（图2）,蛋白水平降低15%（图3）,表明干扰NET-1 的信号通路会降低Survivin 表达,同样干扰Survivin 信号通路会降低NET-1 表达。与control 组比较,转染一链双靶siRNA 组细胞中NET-1 mRNA 和蛋白水平分别降低80%（图2）和85%（图3）,Survivin mRNA 和蛋白水平分别降低77%（图2）和82%（图3）。一链双靶siRNA 组mRNA 和蛋白表达水平明显低于各单靶siRNA 组,差异均有统计学意义（P＜0.05）,表明一链双靶siRNA 组基因沉默效果明显优于单靶siRNA组。siRNA-NC 组与control 组细胞中NET-1 和Survivin mRNA 及蛋白表达比较,差异均无统计学意义（P＞0.05）。

图2 转染siRNA 后各组细胞NET-1和Survivin mRNA 相对表达量

图3 转染siRNA 后各组细胞中NET-1 和Survivin 蛋白表达

2.3 转染siRNA 后各组A431 细胞增殖水平 转染24 h、48 h、72 h 时一链双靶和单靶siRNA 组细胞增殖水平较siRNA-NC 组和control 组降低,差异均有统计学意义（P＜0.05）。一链双靶siRNA 组细胞增殖水平低于siRNA-NET-1 组和siRNA-Survivin 组,差异均有统计学意义（P＜0.05）。单靶siRNA-NET-1 组和siRNA-Survivin 组细胞增殖水平比较,siRNA-NC组与control 组细胞增殖水平比较,差异均无统计学意义（P＞0.05）。见图4。

图4 CCK-8 法检测A431 细胞转染siRNA 后细胞增殖曲线

2.4 转染siRNA 后各组A431 细胞凋亡水平 经Annexin V 和PI 双染色流式细胞仪检测获得由4 个象限组成的细胞散点图,其中左下象限代表活细胞,左上象限代表机械损伤细胞,右下象限代表凋亡细胞,右上象限代表晚期凋亡和死亡细胞。与siRNANC 组和control 组比较,转染NET-1 siRNA 组、Survivin siRNA 组和一链双靶siRNA 组细胞凋亡水平均明显升高,差异均有统计学意义（P＜0.05）。一链双靶siRNA 组凋亡率高于NET-1 siRNA 组和Survivin siRNA 组,差异均有统计学意义（P＜0.05）。siRNANC 组与control 组细胞凋亡率比较,差异无统计学意义（P＞0.05）。见图5。

图5 流式细胞术检测A431 细胞转染siRNA 后细胞凋亡

2.5 细胞免疫荧光检测NET-1 和Survivin 蛋白在细胞内的表达 细胞免疫荧光显示,NET-1 和Survivin 蛋白表达在细胞质和（或）细胞膜中（图6A）。转染siRNA-NET-1&Survivin、siRNA-NET-1、siRNASurvivin 48 h 后,NET-1 和Survivin 蛋白阳性细胞百分率较control 组降低,差异均有统计学意义（P＜0.05）。一链双靶siRNA 组NET-1 和Survivin 蛋白阳性细胞百分率明显低于siRNA-NET-1 和siRNASurvivin 组,差异均有统计学意义（P＜0.05）。siRNANC 组NET-1 和Survivin 蛋白阳性细胞百分率与control 组比较,差异均无统计学意义（P＞0.05）。见图6B。

图6 A431 细胞转染siRNA 各组NET-1 和Survivin 蛋白定位与表达

3 讨 论

NET-1 基因是新近报道的肿瘤相关基因,已发现NET-1 与肿瘤细胞增殖、黏附、迁移、浸润和诱导血管形成密切相关[8-10],并对判断预后有一定价值。本课题组前期研究发现靶向NET-1 的siRNA 抑制A431 细胞增殖、迁移和浸润[11]。Survivin 是迄今发现的最强凋亡抑制因子[7],可能通过抑制正常细胞凋亡信号传导通路,使受损细胞逃避免疫系统的监视而无法清除,从而异常存活、形成优势克隆而参与肿瘤的发生发展。

RNA 干扰技术在肿瘤基因治疗中具有巨大潜力,然而单基因治疗的效果不甚理想,向肿瘤细胞内导入多种相关基因发挥相互协同作用,以提高抗肿瘤效果是基因治疗的发展方向。有证据表明,为了最大限度发挥shRNA 干扰效率,CHEN 等[12]构建同时针对VEGF、hTERT 和Bcl-xl 三种基因的shRNA,然后直接注射到异种移植Hep-2 肿瘤裸鼠体内,结果发现VEGF、hTERT 及Bcl-xl mRNA 和蛋白表达显著降低,肿瘤生长曲线显示其肿瘤治疗效果明显优于对照组和非转染组。

本研究在已筛选确定的单靶NET-1 siRNA 和Survivin siRNA 序列的基础上,构建了针对NET-1和Survivin 基因的一链双靶siRNA。在转染一链双靶siRNA 和单靶siRNA 的同时,以siRNA-NC 作为空载体对照组,排除载体转染对细胞活力的影响,以未转染作为空白对照组,排除试剂对细胞活力的影响。qRT-PCR、Western Blot 和细胞免疫荧光检测表明,一链双靶siRNA 能显著抑制NET-1 和Survivin mRNA 和蛋白表达,抑制效果明显优于单靶siRNA,提示一链双靶siRNA 能同时关闭两个靶基因,从而更有效下调NET-1 和Survivin mRNA 和蛋白表达。CCK-8 法和流式细胞术显示,转染一链双靶siRNA后细胞凋亡率明显升高,细胞增殖显著受到抑制,效果优于单靶组,差异均具有统计学意义（P＜0.05）。免疫共沉淀证实NET-1 和Survivin 存在相互作用,提示NET-1 和Survivin 可联合作为皮肤鳞癌的诊断指标和治疗靶标。