蜂胶对龋病防治作用的研究进展

张伦齐,王 琨,张凌琳,2

蜂胶(propolis)是蜜蜂从植物芽孢和分泌物中提取,并与其分泌的蜡、花粉等混合形成的具有黏性的胶状物[1]。作为一种传统中药成分,蜂胶在医学领域的用途在近年来得到越来越多学者的关注,并已证明其具有多种生物学活性,如抗氧化、抗炎、抗病毒、抗真菌、抗癌等,在口腔保健、食品安全等方面得到广泛应用。

龋病是多年来口腔医学研究的热点问题,对人们的口腔及全身健康有着广泛危害。全国第四次口腔健康流行病学调查结果显示,12岁儿童恒牙龋患率为34.5%,较之上次普查结果,儿童患龋率呈上升趋势; 65～74岁组恒牙患龋率为98%,附着丧失检出率为74.2%,且导致老年人牙列缺损的主要诱因仍为龋病[2]。目前,龋病的防治手段主要是机械法去除牙菌斑以及药物治疗,常用的防龋药物包括氯己定和氟化物,但由于其广谱抗菌的作用,常常会导致口腔内菌群失调;同时,氯己定容易导致色素沉积[3];而氟化物使用不当则有慢性氟中毒的风险。随着人们对口腔保健重视程度的不断提高,寻找更加安全且行之有效的龋病防治手段是当前口腔疾病研究领域的热点内容。本文将针对蜂胶及其有效成分的生物活性及其在龋病防治方面的作用进行综述。

1 蜂胶来源及其主要成分

蜂胶是由蜜蜂通过其下颚腺分泌物与从植物组织中收集到的树脂混合而产生的一种天然且无毒的黏性胶状物,在蜂巢中起密封和杀菌的作用[1]。

蜂胶的化学组成十分复杂,来自不同产地的蜂胶内成分已检测出超过800种[4],就目前的研究而言,其主要成分包括:树脂(50%～70%)、蜡(30%～50%)、花粉(5%～10%)、氨基酸、糖、维生素、类黄酮、芳族化合物等[1,5]。蜂胶中成分除了受植物的影响外,同样受到产地及气候等因素影响,故不同产地的蜂胶其活性成分也有一定的差别。国外常用的蜂胶为热带蜂胶,如巴西绿蜂胶,其主要活性成分为烯萜类和脂肪酸[6];国内研究常使用的蜂胶多为以伊利黑蜂胶为代表的温带型蜂胶,其主要活性成分为咖啡酸苯乙酯(caffeic acid phenethyl ester, CAPE)[7]。

作为一种天然物质,蜂胶的安全性是值得信赖的。有研究表明,蜂胶对小鼠的半数致死剂量(LD50)大于300 mg/kg[8]。就目前的研究来看,蜂胶对人体最大的危害是对蜂胶或其中的成分如花粉等存在过敏反应[9],而对于大多数种类的蜂胶,正常剂量下的体内外研究结果均表明其对人体或小鼠具有较小的不良反应。

2 蜂胶的生物学活性

蜂胶具有一定的抗氧化活性,这主要与其高含量的酚类物质有关。类黄酮是蜂胶中的主要酚类物质,与蜂胶的生物学活性密切相关,其含量的多少被认为是评估蜂胶质量的标准。这些黄酮类物质很大程度上决定了蜂胶抗氧化、抗菌、抗真菌、抗龋和抗癌特性[10]。

2.1 抗菌性能

蜂胶的抗菌性能主要表现在其对不同种类细菌的抑菌作用或杀菌作用,其机制可能与改变细菌细胞膜的通透性,抑制细菌中三磷酸腺苷(ATP)的产生有关[11]。对临床上常见的革兰氏阳性菌——金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌,蜂胶表现出良好的抗菌性能,Al-Ani等研究表明,蜂胶对金黄色葡萄球菌的平均最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC)为0.08～2.50 mg/mL[12]。蜂胶对革兰氏阴性菌也有一定的抗菌性能[13],但根据现有研究,蜂胶对革兰氏阳性菌的抗菌作用更强[12]。

2.2 抗病毒性能

2.3 抗真菌作用

白念珠菌是最常见的真菌病原体之一,并对现有抗生素耐药性逐渐增加[16]。Gucwa等从临床患者中分离出了69种白念珠菌,发现大多数波兰蜂胶的提取物对菌株有抑制作用,且能减少相应菌株的单菌种生物膜的形成量,进一步研究发现蜂胶提取物与氟康唑联合使用能增强对白念珠菌抑制作用[17]。另有研究发现,巴西蜂胶提取物-13型可导致念珠菌属生物膜结构在低浓度(<0.9 μg/mL)时破裂,破坏其完整性和结构[18]。

2.4 抗癌作用

孙小英等使用黑风蜂胶提取物可对肝癌(H22)移植瘤模型小鼠的肿瘤生长有明显的抑制作用,并且抑制肿瘤的作用对剂量存在一定的依赖性,推测其机制为恢复病鼠的自身免疫功能[19]。Seyhan等分离了蜂胶内的各种组分,发现其中的黄酮类化合物对乳腺癌细胞有显著的抑制效果,其中以高良姜精最显著,在5～30 μg/mL剂量下显示出显著的细胞毒性作用[20]。

2.5 抗氧化作用

氧化应激是指在机体抵抗致病菌时,产生的活性氧超过机体抗氧化剂所能代谢上限,进而导致的组织损伤[21]。蜂胶中的CAPE具备较好的抗氧化作用,其主要的作用机制可能与核因子E2相关因子2 (nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2)/血红素加氧酶1(HO-1)信号通路有关;Stähli等的研究证明CAPE可以通过消除自由基,减少细胞凋亡、氧化应激反应来缓解记忆障碍并保护海马体[22]。在急性肝炎大鼠模型中,CAPE可以通过恢复谷胱甘肽水平和谷胱甘肽过氧化物酶活性减少肝损伤[23]。

3 蜂胶的防龋作用研究

龋病是由致龋菌引起的慢性感染性疾病,是口腔内多种微生物与碳水化合物发生复杂的相互作用,产生有机酸使牙釉质、牙本质脱矿的结果。在众多与龋病发生密切相关的致龋菌中,变异链球菌(Streptococcusmutans,S.mutans)、乳杆菌、放线菌发挥了主要作用,除产酸外,这些致龋菌还可合成细胞外多糖,形成多菌种生物膜,并黏附于牙面上[24]。

3.1 蜂胶防龋的机制研究

3.1.1 对致龋菌的抑制作用

Anauate Netto等一项为期28 d的随机对照试验表明,在减少和抑制变形链球菌和乳杆菌的数量方面,2%蜂胶提取物冲洗效果优于1.2%氯己定漱口液冲洗,且在第45天,仍观察到蜂胶抑制S.mutans唾液含量的残留作用[25]。Oda等的研究发现,巴西绿蜂胶(BGP)在较低浓度下对S.mutans的生长即表现出抑制作用,当BGP达到2 g/L时可以明显抑制S.mutans的生长[13],Asgharpour等也测得西班牙蜂胶提取物对S.mutans的MIC值为3.1～25.0 μg/mL[26]。另有研究发现,蜂胶的丙酮提取物对乳酸杆菌显示MIC为6.3 μg/mL[27]。

口腔中常驻的致龋菌大多含有高浓度乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH),该酶能够分解食物中的糖,并形成酸性环境,诱发牙釉质的损伤。有研究发现蜂胶乙醇溶液对浮游状态及生物膜状态下的S.mutans与远缘链球菌的LDH活性抑制作用显著,且乳酸脱氢酶对蜂胶提取物的敏感性比氟化钠更高[28]。另有研究发现,CAPE能显著抑制S.mutans的产酸能力,且抑制能力呈现剂量依赖性[29]。国内外的研究结果有所不同可能与所使用的蜂胶产地不同有关[6-7]。

同时,葡糖基转移酶(glucosyltransferases, Gtfs)膜内原位合成的葡聚糖是致龋菌产生毒力的另一因素[30]。有学者研究发现,在亚MIC浓度下,槲皮素能显著抑制非水溶性胞外多糖的产生[29,31]。Martins等对比0.12%氯己定和3%红蜂胶提取物对细胞外多糖的影响,两者均可降低胞外多糖的含量,但氯己定组中观察到胞外多糖含量降低更显著,研究者将这种效应归因于细菌死亡,而非氯己定抑制细胞外多糖形成[32]。Roach等也发现,比起单独使用氟化钠,蜂胶提取物在与氟化钠联用时,可增加葡聚糖,特别是水溶性葡聚糖的降低量,达到与0.12%氯己定相似的效果[33]。

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3.1.2 对致龋生物膜形成的抑制作用

此前的研究已经证明,致龋菌的黏附机制分为蔗糖独立性黏附和蔗糖依赖性黏附。前者通常指黏附素发生非特异性黏附,后者则指Gtfs利用蔗糖合成的葡聚糖与葡聚糖结合蛋白(glucan-binding protein,Gbps)结合[5,34],蜂胶提取物及其多种化学成分主要通过对后者的抑制作用抑制生物膜的形成。Veloz等报道了蜂胶提取物在终浓度为0.4 mg/mL时,几乎完全抑制了S.mutans的黏附作用[35]。另有研究认为芹菜素通过干扰Gtfs,特别是葡糖基转移酶B(glucosyltransferase-B,GtfB)、葡糖基转移酶C(glucosyltransferase-C,GtfC)活性,减少以α-1,3糖苷键为主的葡聚糖的生成,并降低了S.mutans对玻璃表面的黏附作用,从而对生物膜形成产生影响[36]。蜂胶中提取的槲皮素可调节relA、brpA、gtfC、covR、comDE和smu630基因的表达,并与1-脱氧野尻霉素协同作用,减少表面抗原Ag Ⅰ/Ⅱ的数量,阻碍细菌间相互作用,从而阻止生物膜形成[37]。Niu等推测,蜂胶中的CAPE通过抑制Gtfs相关调节基因(如VicK、VicR和CcpaA)的表达,减少了蔗糖依赖性黏附,从而抑制致龋生物膜的形成,并且这种抑制呈现剂量依赖性[29]。

3.1.3 对成熟生物膜的清除作用

成熟期的生物膜可以提高致龋菌对机械和药物清除的抵抗力,生物膜中的细菌对抗生素等药物的抗性通常是浮游菌的10～1 000倍,并能维持致龋菌产生的酸性环境,具有更高的毒力作用[38-39],生物膜成熟后,通过破坏其结构可促进其在载体表面的脱落。Zeng等使用从蜂胶中提取出的槲皮素处理成熟期S.mutans生物膜后,发现生物膜中的活细胞数量明显减少,扫描电镜显示,与对照组相比,处理组生物膜结构疏松多孔,细胞外基质间连接明显减少[31]。有研究证明,土耳其蜂胶对乳酸杆菌和放线菌的单菌最小生物膜清除浓度分别为512和128 μg/mL ,且对其他致龋相关的致病菌生长具有一定抑制作用[26]。也有研究用巴西红蜂胶处理形成7 d后成熟的多菌种生物膜(包含链球菌属、放线菌属)24 h,以模拟阿莫西林全身用药的情况,发现400 μg/mL的蜂胶提取物显著降低生物膜的代谢活性和生物膜中链球菌的数量,并减小生物膜厚度[40]。

3.2 蜂胶防龋的应用研究

根据蜂胶对S.mutans等致龋菌多方面的抑制作用,可以考虑将其添加进牙膏、漱口水、涂料中,从而抑制龋病的进展[41]。

3.2.1 漱口水

Dehghani等使用1%蜂胶漱口水作为试验组进行双盲试验,结果显示,使用蜂胶漱口水对龈上菌斑的形成有显著抑制作用,能显著改善口腔健康问题[42]。Bapat等在一项为期3个月的研究中发现,蜂胶漱口水对牙菌斑的抑制作用与氯己定相似[43]。在体外实验中,0.8%红蜂胶漱口水对血链球菌和S.mutans有一定的抑制作用,但不能抑制其胞外多糖的产生[44]。Vanni等的研究却认为,蜂胶漱口水对S.mutans形成的单菌种生物膜没有抑制作用[45]。

3.2.2 牙膏

Smolarek等通过抑菌环实验对市场上现有的中草药牙膏进行对比分析,发现含有蜂胶以及白千层的牙膏对S.mutans的抑制效果最佳,产生较大直径的抑菌环[46]。同时,Demir等的研究发现,含有蜂胶的牙膏仅对S.mutans有抑制作用,但对血链球菌和粪肠球菌无作用[47]。Vanni等的研究中,含有0.9%蜂胶的牙膏对S.mutans的抑制作用弱于0.12%氯己定[45]。体内研究方面,Wiatrack等将茶树油和蜂胶提取物添加到牙膏内,发现与普通牙膏相比,在试验28 d后,前者可显著降低受试者的菌斑指数,以及包括放线菌、乳杆菌在内的细菌数量[48]。在一项为期35 d的随机对照研究中,添加3%蜂胶提取物的牙膏可显著降低正畸治疗患者的牙菌斑指数[49]。

3.2.3 涂料

DE Luca等研究了蜂胶涂料对感染S.mutans雌性大鼠的抗龋作用,结果表明,含蜂胶涂料可以显著降低大鼠光滑面龋的发生率,且与2.26%的含氟涂料有相似的效果,但蜂胶涂料对牙本质龋和窝沟龋均没有良好的防治效果[50]。另有研究2.5%巴西红蜂胶涂料预防儿童龋齿的抗菌功效,选取了50名高患龋风险儿童,分别给予5%含氟涂料、2.5%蜂胶涂料,蜂胶涂料在使用后90 d内可有效控制口腔中S.mutans的增殖[51]。

上述研究表明蜂胶可以以牙膏、漱口水、涂料等形式作用于口腔局部发挥效果,在未来可以作为氯己定天然替代药物。但是由于蜂胶成分的复杂性,研究结果存在差异。在正式投入使用前,仍需寻找适用于防治龋病的蜂胶种类,并通过动物和人体研究来确定其安全剂量。

4 总结与展望

随着人们对口腔健康的关注度日益提升,蜂胶作为具有多种生物学活性的天然产物,可以通过加入漱口水、牙膏、涂料等口腔护理或保健品中发挥抗龋作用。然而,就目前的研究进展来看,蜂胶能否成为稳定且高效的物质还需要进一步的研究论证,并且不同产地蜂胶化学成分差异可能导致不同的研究结果和生物效应,也需要进一步验证蜂胶发挥作用的成分及其机制。尽管蜂胶具有很高的安全性且相对无毒[8],但仍有过敏反应等不良反应的报道,使用蜂胶的安全性仍然有待考证[9]。

综上所述,蜂胶在龋病防治领域具有很广阔的应用前景,未来有关蜂胶研究应兼顾其成分机制和安全性。在此基础上,蜂胶有望成为一种能够防治龋病的天然药物。