高效液相色谱法对养胃合剂中芍药苷的含量测定与方法学研究

李桂芹,杨景然,和文宇,赵树花,刘宇,张宝洪

慢性胃炎是由各种病因引起的胃黏膜慢性炎性反应,发病率在多种慢性胃病中居第一位[1-2]。该病临床主要表现为胃脘部疼痛、饱胀、恶心呕吐、反酸及纳呆等,西医主要给予对症治疗,但总体疗效较仍有欠缺。慢性胃炎病程长,病情易反复发作,严重影响患者的生活质量[3-4]。养胃合剂系云南省第一人民医院临床使用多年的经方中药复方制剂,由北沙参、白芍、黄芩、木香、炒麦芽、炒谷芽、陈皮、厚朴和甘草等组成,具有养胃健脾、行气消胀、和胃止痛之功效,可治疗胃脘胀痛、消化不良,如慢性胃炎等疾病。养胃合剂安全性高,药效肯定。中医讲究辨证论治,望闻问切,用药须合中医理论的君、臣、佐、使。由于复方中药方剂中所用药材众多,明确复方方剂中的君药、臣药、佐药和使药并对其进行质量控制,对保证药效至关重要。为更好地确保药材质量,本研究以方剂中白芍[5]为主要成分作为质控指标,采用高效液相色谱法测定,测定芍药苷含量[5-9]。本研究旨在建立养胃合剂的质量控制方法和标准并对方法进行分析探讨。

1 材料与方法

1.1 仪器 LC-1260液相色谱仪(配有1260泵、1260自动进样器和紫外检测器,美国Agilent公司),XW-8柱温箱(天津奥特恩斯仪器有限公司),CPA225D型电子天平(赛多利斯),KQ-500B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试药及试剂 芍药苷对照品(批号：110736-201842)为中国食品药品检定研究院提供。甲醇和乙腈(色谱纯,Sigma公司),磷酸和乙醇(分析纯,天津市风船化学试剂有限公司)。实验用水为蒸馏水;其他试剂均为分析纯。供试品(样品)：养胃合剂(云南省第一人民医院制剂,批号：20181122、20181129、20181205,规格：200 ml/瓶)。样品含北沙参、白芍等。本品每1 g含白芍以芍药苷(C23H28O11)计,不得少于0.90 mg。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：ACE-EXL-121-2546U(C18,250 mm×4.6 mm,5 μm),流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液(14∶86),流速1.0 ml/min,检测波长230 nm,柱温25 ℃。

2.2 制备对照品溶液 取对照品芍药苷,精密称定,加入稀乙醇溶液,随后制备成每1 ml含60 μg的对照品溶液,备用。

2.3 制备供试品溶液 取供试品养胃合剂(批号：20181122)约1 g,精密称定,置于带玻璃塞的锥形瓶中,加稀乙醇溶液50.0 ml,随后称定重量,进行超声处理(功率240 W,频率45 kHz)30 min,自然冷却,加稀乙醇溶液以补足减失的重量,反复振摇,滤过,作为供试品溶液,备用。

2.4 制备阴性对照品溶液 按处方比例,取不含白芍药材的阴性对照样品,加水煎煮两次,每次1 h,浓缩成浸膏,按照制备处方工艺加入比例的辅料,混匀。按“2.3”项制成不含芍药的阴性对照品溶液,备用。

2.5 系统适用性试验 精密吸取芍药苷对照品、养胃合剂供试品和阴性对照品溶液各10 μl,自动进样于高效液相色谱中,按“2.1”项色谱条件进样分析,记录色谱图,见图1-3。阴性对照品色谱图与芍药苷对照品、养胃合剂供试品色谱图中相应的保留时间处无色谱峰出现,表明阴性对照品无干扰,方法专属性好。

2.6 考察线性范围 精密吸取“2.2”项的芍药苷对照品溶液2、5、10、20、25 μl,自动进样于高效液相色谱中,测其峰面积。以峰面积积分值为纵坐标,芍药苷对照品的进样量为横坐标,进行线性回归,回归方程：芍药苷Y=1306.6X-4.7384,r=1.0000,表明芍药苷在0.11788～1.4735 μg范围内呈良好的线性关系。

图2 供试品溶液色谱图

图3 阴性对照品溶液色谱图

2.7 精密度试验 精密吸取“2.2”项的芍药苷对照品溶液10 μl,自动进样于高效液相色谱中,连续进样6次,记录峰面积,芍药苷峰面积RSD为0.77%,表明仪器精密度良好。

2.8 重复性试验 称取同一批次养胃合剂(批号：20181122)6份,按“2.3”项供试品溶液制备方法平行制备,精密吸取各10 μl,自动进样于高效液相色谱中,芍药苷峰面积RSD为1.85%,表明该方法重复性良好。

2.9 稳定性试验 取“2.3”项供试品溶液,于室温下存放,分别于0、2、4、6、17、25 h精密吸取供试品溶液10 μl,自动进样于高效液相色谱中,芍药苷峰面积RSD为1.25%,表明供试品溶液在25 h内稳定性良好。

2.10 加样回收试验 称取同一批次养胃合剂(批号：20181122,含量0.207%)0.5 g,精密称取6份,置带有玻璃塞的锥形瓶中。分别精密加入芍药苷对照品溶液(浓度0.9867 mg/ml)0.8、1.0和1.2 ml各2份,按“2.3”项下制备供试品溶液,按“2.1”项色谱条件测定,芍药苷回收率为104.1%,RSD为1.52%。表明该法回收率好,满足回收率限度90%～108%的要求,见表1。

表1 芍药苷的加样回收试验 (n=6)

2.11 样品含量测定 取3批养胃合剂(批号：20181122、20181129、20181205)0.5 g,每批取2份,精密称取6份,按“2.3”项进行制备,精密吸取各10 μl,注入高效液相色谱仪,测定含量,见表2。据3批样品芍药苷的含量测定,平均每1 g养胃合剂含芍药苷1.94 mg。由于药材随产地、批次不同,其含量略有差异,依据白芍饮片芍药苷含量限度为不得少于1.2%投料计算,制得成品的含量为0.92 mg/g。考虑到提取过程中偏差,故每1 g含白芍以芍药苷(C23H28O11)计,不得少于0.90 mg。

表2 3批养胃合剂样品中芍药苷的含量

3 讨 论

养胃合剂中北沙参和白芍为君药、黄芪、厚朴、陈皮和木香为臣药,丹参、焦山楂、炒麦芽和炒谷芽为佐药,甘草为使药。白芍是一种用药历史悠久的传统中药,其药用资源丰富,《本经》记载其“主邪气腹痛,除血痹,破坚积,治寒热疝瘕,止痛,利小便,益气”,因其功效丰富,被广泛应用于中西医临床治病研究[10]。现代药理学研究表明,白芍含有效成分芍药苷,具有免疫调节、抗炎、肝保护、脑和神经保护、心血管保护等多种作用,其中肝保护、脑和神经保护、心血管保护功能多依托于芍药苷降低氧化应激损伤、调控促炎因子减少炎性反应损伤和调控细胞凋亡的药理活性[11-13],与本品针对慢性胃炎具有极强的相关性。

芍药苷的提取工艺有乙醇超声提取、乙醇回流提取、乙醇索氏提取和水提取。张腾腾等[14]研究表明,采用醇溶液超声提取芍药苷方法简便、提取率高、价格低廉。对于提取溶剂及方式的选择,本试验在不同溶剂甲醇、乙醇和稀乙醇中进行超声处理(功率240 W,频率45 kHz)和回流提取各30 min,测定养胃合剂中芍药苷的含量,结果表明同一提取方式下稀乙醇提取能力最高,同一提取溶剂下相同提取时间,超声提取能力与回流相似。故确定提取溶剂为稀乙醇,因超声提取法实验设备简单、操作方便,提取时间短,提取效率高,无需加热,故选用超声提取法。对于提取时间的考察,在用超声处理(功率240 W,频率45 kHz)分别提取30、60、90 min,测定芍药苷的含量,结果表明超声提取30 min与60、90 min提取几乎完全,效率一致,故确定超声提取时间为30 min。

白芍具有抗炎、保肝、镇痛、养血等药理作用。白芍总苷是白芍的提取有效部位,主要包括芍药苷、芍药内酯苷、氧化芍药苷等成分[15]。由于近年的实验中多以白芍总苷为整体分析对象进行药理研究,少见对其具体成分进行分离解析,因此可对白芍单体成分进行分析,进一步利用中药多成分、多靶点的特点,扩大临床治疗范围,充分发挥药理活性[5]。车娅莉等[16]对中国16个产地的白芍和赤芍的芍药苷成分进行测定,结果表明,野生芍药根中芍药苷的质量分数大于6.0%,D儿茶素质量分数高于0.05%,而未加工的人工栽培芍药根中芍药苷的质量分数小于6.0%,未检测到D儿茶素,说明不同产地、特别是道地与非道地的白芍药材之间芍药苷含量存在明显差异。因此在制剂中,应明确标明药用产地,为标准建立提供支撑和依据。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突。