虾肝肠胞虫实时荧光定量PCR 检测方法的建立及应用

张先东，付静静，刘伟琪，罗颖，邓桦，杨鸿，侯月娥

（1.佛山科学技术学院生命科学与工程学院，广东 佛山 528000；2.珠海科艺普检测科技有限公司，广东 珠海 519000）

虾肝肠胞虫属于微孢子虫门（Microsporidia）、肠胞虫科（Enterocytozoonidae）、肠胞虫属（Enterocytozoon），是一种专性胞内寄生虫，能使对虾生长缓慢、大小不一，空耗饲料，是对虾养殖业减产和成本增加的重要病原之一[1]，2004 年由泰国研究者从生长缓慢的斑节虾（Penaeus monodon）体内首次发现，2009 年被分离及命名[2]。近年来，我国沿海主要养殖区域南美白对虾虾苗、成虾以及塘底泥和水源中均有检测到EHP 的报道，部分地区检出率处于较高水平[3]。随着国内南美白对虾养殖规模的不断扩大，EHP 又能通过水平和垂直方式传播，且暂未发现有效的防控药物，导致养殖风险日趋严峻[4]。感染对虾30 d 左右才会观察到生长缓慢的现象，继续养殖只会造成饲料空耗，只能通过“排塘”方式及时止损，增加了养殖成本[5]。因此，建立一种准确的检测方法能及时发现并降低病原携带风险，及时发现及时止损。

目前主要的检测方法有染色镜检、普通PCR、巢式PCR、实时荧光定量PCR、原位杂交、环介导等温扩增技术和RPA 技术等[1]。常晓晴等[6]比较了几种常用的染色方法，发现Masson 染色对组织的染色效果最佳，检出率高，但是该方法对感染早期或载量低的样品检出效果较差。EHP 分子检测方法的开发主要基于EHP 小亚基核糖体RNA（Small subunit ribosomal RNA，SSU rRNA）、孢壁蛋白（Spore wall protein，SWP）、18S 核糖体RNA（18S ribosomal RNA，18S rRNA）。比较基于上述三种基因保守序列建立的巢式PCR 后发现，基于SSU rRNA 的巢式PCR 具有较好的灵敏度和特异性[7]。陈进会等[8]基于18S 核糖体保守区域建立了检测EHP 的LAMP法。该方法能在30 min 内完成，检测限为0.44 pg·μL-1。马来等[9]基于SSU rRNA 和TaqMan-MGB 探针建立的方法灵敏度低至10 copies·mg-1。侯月娥等[10]建立了能同时检测EHP 和虾血细胞虹彩病毒（Shrimp Hemocyte Iridovirus，SHIV）的qPCR，检测限为10 copies·μL-1，是普通PCR 的100 倍。Li 等[11]建立的RPA 方法在38.5℃条件下耗时15 min 即可完成对EHP 的检测，检测限为10 copies·μL-1，成本比qPCR 更低。由于对检测时效性和准确性要求较高，而实时荧光定量PCR 技术成熟，准确性高、耗时短、能实现定量检测病原，目前已被国内外实验室广泛使用[3]。

本研究拟建立基于EHP 18S rRNA 基因保守序列的实时荧光定量PCR 法，利用建立的方法，对珠三角部分地区主要养殖区南美白对虾（Litopenaeus vannamei）虾苗及成虾样品进行检测，调查EHP 在珠三角部分地区的流行情况，旨在提高当地养殖者的防控意识，同时为EHP 的防控提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源

虾肝肠胞虫阳性样品来自珠海科艺普检测科技有限公司，并已经过PCR 扩增及测序。

检测样品主要来自珠海市、中山市、江门市等地密集养殖区养殖户和虾苗场，其中南美白对虾虾苗样品699 份、成虾样品135 份。虾苗样品采用充氧袋装，成虾样品带水瓶装或使用95%酒精浸泡，将采集的样品快速送至实验室进行处理，保存在-20℃冰箱中待测。

1.1.2 主要试剂

病毒DNA/RNA 小量制备试剂盒购自广州吉瑞基因科技有限公司；琼脂糖凝胶DNA 纯化回收试剂盒、普通质粒小量提取试剂盒均购自Omega 公司；2×Taq Man qPCR Mix 购自大连宝生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物与探针的设计合成

根据GenBank 中虾肝肠胞虫18S 基因序列（登录号：KX932044），结合Primer Premier 5 和Oligo7软件，设计特异性的引物和荧光探针（表1），由上海辉睿生物科技有限公司合成。

表1 引物和探针序列Tab.1 Sequences of primers and probe

1.2.2 样品前处理

将虾苗装入内有钢珠的研磨管中，不超过管内体积的2/3，加入0.5～1 mL PBS，将研磨管置于组织研磨仪中研磨3 min，取出研磨管10 000 r/min 离心1 min，吸取上清液200 μL 到离心管中备用。

剪取成虾样品肝胰腺、鳃、肌肉到研磨管中，后续处理同虾苗。

1.2.3 核酸提取

按照广州吉瑞基因科技有限公司的病毒DNA/RNA 小量提取试剂盒说明书提取虾苗及成虾样品的基因组DNA。

1.2.4 标准品的制备

将提取的基因组DNA 进行EHP 目的基因的扩增。扩增条件：95℃预变性5 min；95℃变性30 s；58℃退火30 s；72℃延伸30 s；共40 个循环；在反应结束后，取5 μL PCR 产物琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收纯化，克隆到PUC57 载体中，转化到DH5α 感受态细胞，筛选阳性克隆重组质粒，送至上海生工生物工程科技有限公司测序鉴定，同时对阳性质粒进行浓度测定、拷贝数计算，分装，-80℃保存备用。

1.2.5 方法的建立及反应条件的优化

qPCR 反应体系参照2×Taq Man qPCR Mix 试剂盒说明书进行配制。将引物和探针稀释为不同终浓度（0.1～0.6 μmol·L-1），反应体系为25 μL，2× Taq Man qPCR Mix 12.5 μL，模板DNA 2 μL，用ddH2O水补足。扩增程序为：95℃预变性5 min；95℃变性10 s；退火温度范围设计为55℃～65℃，30 s，40 个循环，根据不同条件进行优化，筛选出最佳的引物及探针浓度，确定最佳退火温度。

1.2.6 标准曲线的建立

将制备好的EHP 标准品进行10 倍梯度稀释，稀释后浓度为1.3×107～1.3×101copies·μL-1，共7个梯度。以稀释好的标准品为模板，使用1.2.5 筛选优化后的体系及条件进行qPCR 扩增。根据标准品拷贝数与Ct 值建立标准曲线。

1.2.7 敏感性试验

将按照1.2.3 提取的阳性样品核酸进行10 倍梯度稀释（100～10-4），以各梯度核酸为模板，用建立的qPCR 和标准《南美白对虾肝肠胞虫巢式聚合酶链式反应检测方法（DB32/T 3802—2020）》分别对各梯度核酸进行扩增，比较两种方法的灵敏度。

1.2.8 特异性试验

选择本实验室保存的十足目虹彩病毒1（Infection with decapod iridescent virus 1,DIV1）、白斑综合症病毒（White spot syndrome virus，WSSV）、传染性皮下造血器官坏死病毒（Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus，IHHNV）的核酸为模板，以EHP 阳性样品提取的核酸为阳性对照，以健康对虾核酸为模板作为阴性对照，ddH2O 作为空白对照，使用建立的方法进行扩增。

1.2.9 重复性试验

用建立的方法对已稀释的梯度质粒（1.3×106copies·μL-1、1.3×104copies·μL-1和1.3×102copies·μL-1）进行批内重复试验。将各梯度质粒在-20℃储存30 d 后进行批间重复试验，每个浓度重复3 次。对结果进行方差分析，计算批内和批间的变异系数。

1.2.10 样品检测

使用qPCR 与巢式PCR 同时检测部分实际样品。应用qPCR 检测珠三角部分地区采集的南美白对虾虾苗、成虾样品，了解EHP 在该地区的流行情况，为当地水产养殖业提供一定的参考。

2 结果与分析

2.1 标准品的制备

将重组质粒进行PCR 扩增后获得的目的片段与预期大小一致。测序结果分析发现，EHP 目的基因序列与GenBank 公布的参考序列KX932044 的同源性为100%，表明目的基因成功克隆到PUC57载体中，成功构建了重组质粒，重组质粒的浓度为50 ng·μL-1，通过拷贝数计算公式，换算成拷贝数1.3×1010copies·μL-1，将其作为标准品保存在-80℃备用。

2.2 反应条件的优化

比较和优化了不同浓度下的引物及探针浓度、退火温度，确定反应体系为25 μL：2×Taq Man qPCR Mix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，探针0.5 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O 8 μL。在反应体系中上下游引物最佳浓度为0.4 μmol·L-1，探针0.2 μmol·L-1。PCR 条件：95℃预变性5 min；95℃变性10 s；退火温度60℃，30 s；40 个循环。

2.3 标准曲线的建立

利用本方法扩增了不同梯度（1.3×107～1.3×101copies·μL-1）稀释的标准品，结果见图1。建立扩增产物循环数Ct 值（Y）与标准模板拷贝数对数值Log（Conc）（X）关系的标准曲线（图2）。标准曲线为Ct=-3.21Log（Conc）+38.26，相关系数R2=0.998，扩增效率为104.9%。

图1 EHP 标准品模板扩增曲线Fig.1 Amplification Curve of EHP standard templates

图2 EHP 标准品模板扩增标准曲线Fig.2 The standard curve of EHP standard template

2.4 敏感性试验

将10 倍梯度稀释后的EHP 阳性核酸（100、10-1、10-2、10-3、10-4）分别用本试验建立的方法和巢式PCR 进行扩增（图3、图4）。扩增曲线表明，本试验建立的方法可以在100～10-3范围内检测到扩增的荧光信号，而巢式PCR 第一轮能在100～10-1观察到明亮的电泳条带，10-2能观察到微弱的电泳条带，第二轮在100～10-2观察到明亮的电泳条带。本试验建立方法的灵敏度是巢式PCR 的10 倍。

图3 qPCR 灵敏度检测结果Fig.3 Sensitivity test of qPCR method

图4 巢式PCR 灵敏度检测结果Fig.4 Sensitivity test of nested PCR method

2.5 特异性试验

以WSSV、IHHNV、DIV1、EHP 阳性核酸、健康对虾核酸和去离子水为模板，用EHP 引物进行扩增，只有EHP 阳性核酸模板检测到了荧光信号，为阳性，其他病毒、阴性对照、空白对照均未检测到荧光信号，均为阴性（图5）。

图5 qPCR 特异性检测结果Fig.5 Specificity of qPCR method

2.6 重复性试验

不同浓度标准品按要求进行扩增后，批内、批间的均值、方差及变异系数见表2。结果发现：批内批间的变异系数均小于1.5%，表明该方法的稳定性良好。

表2 重复性试验结果Tab.2 Repeatability test

2.7 样品检测

2.7.1 qPCR 与巢式PCR 同时检测临床样品效果比较

分别使用建立的qPCR 和巢式PCR 对183 份临床样品进行检测，其中有161 份均检测为阴性，18 份均检测为阳性。使用qPCR 检测出阳性22 份，Ct 值在17.56～35.12 之间，换算成拷贝数为0.95×101～2.05×106copies·μL-1。有4 份样品使用巢式PCR 未检出，使用qPCR 检测Ct 值在31.28～35.12之间，换算成拷贝数为0.95×101～1.49×102copies·μL-1。两种方法符合率为97.81%。

2.7.2 应用qPCR 对珠三角部分地区样品检测结果

用建立的qPCR 检测珠三角部分地区采集的南美白对虾虾苗及成虾样品，结果表明，调查地区的虾苗及成虾样品均有检出，其中中山市虾苗及成虾检出率最低，分别为5.38%（7/130）、43.24%（16/37）；江门市虾苗及成虾检出率最高，分别为18.55%（23/124）、66.67%（30/45）；虾苗总体检出率为10.75%（75/699），成虾总体检出率为54.07%（73/135），成虾检出率较高（表3）。

表3 珠三角部分地区样品中EHP 检出率/%Tab.3 Detection rate of EHP in samples from parts of Pearl River Delta region

3 讨论

对虾感染EHP 后不会直接死亡，主要引起对虾生长缓慢。有研究表明，EHP 感染后会改变对虾肠道优势菌群的种类，改变菌群结构多样性，降低了机体的抵抗力，增加机体对其他疾病（如急性肝胰腺坏死、感染性肝胰腺坏死、弧菌等）的易感性[12,13]。通过与未知病原混合感染，可能会导致白便综合征，粪便将EHP 孢子传播到水体中进一步扩散[14]。由于没有有效的治疗药物，而且塘底泥和水体中的EHP 孢子不易被杀灭，因此切断传染源和传播途径是防控EHP 的重要手段，如加强对虾苗、虾料、塘底泥和水源的检测，选择优质苗种、虾料，通过检测结果指导有效处理水源和塘底泥。

近年来，qPCR 已被国内外实验室广泛使用，技术成熟、灵敏度和特异性高、稳定可靠。本研究根据EHP 的18S rRNA 保守区域设计特异性的引物和探针，通过优化反应体系、引物及探针浓度、退火温度以及循环数，提高方法的灵敏度、特异性和可重复性，开发一种能准确检测EHP 的qPCR 方法。结果表明，建立的方法检测限为1.3×101copies·μL-1，是巢式PCR 的10 倍，灵敏度高。与其他常见疾病无交叉反应，特异性良好。批内批间的变异系数均小于1.5%，稳定性良好。与巢式PCR 检测实际样品相比符合率为97.81%，qPCR 能检测到更低载毒量的样品，且耗时更短，操作更简单。

本研究建立的方法与前期马来等[9]建立的qPCR检测限相近，高于刘珍等[15]基于SSU 基因、汪浩等[16]基于SWP 基因建立的SYBR qPCR 的灵敏度。使用建立的方法对珠三角部分地区收集的南美白对虾虾苗及成虾样品均有检出，成虾检出率较高。其中江门市虾苗及成虾样品中检出率均较高，中山市虾苗及成虾样品检出率最低。苗种质量和养殖水平可能是造成检出率较高的重要原因。调查地区虾苗总体检出率为10.75%，成虾总体检出率为54.07%。前期有研究者在粤西地区对虾样品EHP检出率为41.38%，汕尾、茂名等地幼虾EHP 检出率为20%～40%[17,18]。结合本次调查结果说明，EHP 在广东沿海主要养殖区呈现流行趋势，部分地区检出率较高，需防范爆发风险。本研究建立的方法灵敏度高、特异性和稳定性良好、耗时短，在临床样品检测中结果可靠，应用前景良好。