红螯螯虾低温胁迫下应激行为及抗低温措施研究

张艳春，叶传剑，刘炬涛，田璐，梁志强，肖光明

（1.湖南省畜牧水产事务中心，湖南 长沙 410006；2.湖南君博科技发展有限公司，湖南 长沙 410036；3.湖南住友农业科技责任有限公司，湖南 湘潭 411202；4.湖南省水产科学研究所，湖南 长沙 410153）

红螯螯虾（Cherax quadricarinatus），又名澳洲淡水龙虾，外形酷似海中龙虾，隶属于十足目（Decapoda）拟螯虾科（Parastacidae）红螯螯虾属（Cherax），原产于澳大利亚北部热带区域，是世界上经济价值较高的虾类之一[1]。全球22 个国家有红螯螯虾野生种群[2]。1992 年我国广东、湖北引进该虾并试养成功[3]。红螯螯虾生长快，适应性和抗病力较强，耐低氧，成活率较高，一般当年放养当年捕捞上市，有利于活虾供应市场，适宜推广养殖。近年来，克氏原螯虾（Procambarus clarkii，又名小龙虾）行业迅猛发展，而红螯螯虾质优味美，出肉率是克氏原螯虾的2 倍多[4]，也带动了红螯螯虾行业的兴起。

红螯螯虾生长、发育、繁殖与温度变化极为敏感，最适温度24℃～30℃。低温应激使红螯螯虾肝胰腺细胞凋亡显著增加，抑制新陈代谢受，机能减弱，氧化损伤和免疫缺陷[5]。温度骤变往往导致其生长停滞甚至死亡，严重危害红螯螯虾养殖业[6,7]。国内外对虾类抗低温措施有少量研究：凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）在11℃低温胁迫下，最长应激措施处理时间为6 d，在7℃低温，须在1 d 内完成补救措施[8]。低温条件下凡纳滨对虾的消化酶活性发生改变，生产中常根据不同温度情况调整饵料成分的配比和投饵量以应对低温应激[9,10]。目前，有关低温下红螯螯虾研究主要集中在对其存活率的影响。吴志新等[11]研究发现红螯螯虾虾苗耐受15℃低温，10℃仅存活8 d。李继勋等[12]试养红螯螯虾中，当夜间水温6℃、白天水温9℃的短期波动下没有出现死亡。王福刚等[13]研究发现，9℃左右幼虾难以存活，而成虾存活率可达67%。张湘昭[14]研究发现水温降至8℃时则死亡。红螯螯虾能在3℃低温短时间停留，低于14℃不再生长[2,15]。目前，红螯螯虾的低温应激行为研究资料极少，有关其抗低温措施的研究尚未见报道。红螯螯虾在中国湖南、湖北等亚热带地区养殖时，寒潮、倒春寒等极端天气可给红螯螯虾养殖业带来毁灭性灾害。因此，本实验旨在系统地观察红螯螯虾不同低温条件下的应激行为，并通过增强饲料营养，提高虾机体自身抵抗低温胁迫能力，探索抗低温措施，为亚热带地区红螯螯虾养殖中应对寒潮、倒春寒等极端天气提供急需的解决措施，促进其产业发展。

1 材料与方法

1.1 材料

实验所用红螯螯虾来自湖南长沙君博科技有限公司温棚养殖群体，体质量（70±2.52）g，实验初期在21℃～23℃水温中增强体质30 d，分池投喂两种饲料，一池投喂正常南美白对虾配合饲料，粗蛋白含量41%，粗脂肪含量4%。另一池塘投喂抗低温饲料，饲料中添加多种营养物质，其中牛磺酸占0.3%、葡聚糖0.03%、虾青素0.03%、EM菌0.3%、粗蛋白32%、粗脂肪11%。实验开始时共挑选体质量大小相当、虾体完好无损，无伤病的红螯螯虾240尾作为实验材料。

本实验中使用了如下动保产品：楚牛牌饲料添加剂牛磺酸（潜江永安药业股份有限公司），WANBANG 食品添加剂β-葡聚糖（河南万邦实业有限公司），D-BASF 饲料添加剂10%虾青素（巴斯夫欧洲公司），鱼虾拌料王EM 菌液（河南南华千牧生物科技有限责任公司），使用小型面条机（长沙旭众机械设备有限公司）制成长条形饲料，60℃下烘箱中烘干，粉碎成大小适宜颗粒。

1.2 方法

实验在12 个HDPE 高密度聚乙烯养殖箱（60 cm×50 cm×40 cm）中进行，实验设置4 个组：强化急降组（GJ）、强化缓降组（GH）、常规急降组（CJ）、常规缓降组（CH），每组3 个平行，每个平行组20 尾红螯螯虾。采用苏州星河电子智能温控器调节水温，采用30 cm 超长探针笔式电子温度计（SANYWUN）测定实时温度，实验用水为经24 h 曝气的自来水，采用自制吸污管各组同步吸除残饵与粪便。

本研究通过控制降温缓急策略与改善饲料成分来设计实验方案。根据实验要求，缓降组分为常规缓降组、强化缓降组，急降组分为常规急降组、强化急降组。实验初期，各组经过体质增强期后从室温匀速升温至25℃，适应期为8 d，然后，进入中温胁迫期，急降组（CJ、GJ），3 d 内降温至18℃，此后20 d 维持18℃不变；缓降组（CH、GH）7 d 内降温至18℃，此后16 d 维持18℃不变，最后为低温胁迫期，急降组，3 d 内由18℃降温至低温6℃，此后7 d维持温度不变；缓降组，7 d 内由18℃降温至室外低温6℃，此后3 d 维持温度不变（图1）。其中，常规急降组、常规缓降组在体制增强期（30 d）内均投喂常规饲料；其中，强化急降组、强化缓降组在体制增强期内均投喂抗低温饲料。每日早、晚各观察记录低温胁迫下红螯螯虾进食、活动、存活情况一次。实验中，死亡虾的断定标准为：鳃丝停止摆动或针尖刺激无反应。实验数据通过Excel 统计整理分析，采用SPSS22.0 软件对组别数据进行独立样本卡方检验，以P＜0.05 表示差异显著。

图1 实验温度设计示意图Fig.1 Schematic diagram of test temperature design

2 结果与分析

2.1 低温胁迫期对红螯螯虾存活的影响

在适应期（图1-B），4 个实验组红螯螯虾都没有出现死亡。在中温胁迫期（图1-C），两个常规组死亡率均为1.67%，两个强化组都未死亡。在低温胁迫期（图1-D），各组大规模死亡均在低温恒温阶段（6℃），在各时期阶段中死亡率最高，常规急降组全部致死，单天最高死亡率为75%；常规缓降组该期死亡率为（41.67±7.26）%，大规模死亡在低温恒温阶段，单天最高死亡率为50%；强化急降组该期死亡率为（11.67±6.67）%，单天最高死亡率为20%；强化缓降组该期死亡率为（10.00±2.89）%，单天最高死亡率为15%；低温胁迫期，常规急降组（CJ）死亡率均显著高于其他3 组；强化组中，强化急降组与缓降组无显著差异（P>0.05，图2）。

2.2 低温应激对红螯螯虾摄食的影响

在适应期，4 个组红螯螯虾都正常摄食；在中温胁迫期，两个常规组和强化缓降组均在18℃恒温阶段少量进食；在低温胁迫期，四个组均不进食，常规急降组、常规缓降组、强化急降组、强化缓降组开始出现此现象的水温分别为16℃、15℃、14℃和14℃（图3）。

在适应期和中温胁迫期，四个组的红螯螯虾都活力正常。在低温胁迫期开始出现活力异常，常规急降组随着温度的下降先后出现应激反应：至16℃时活动减弱，9℃时卷曲、侧翻，6℃时断螯。常规缓降组随着温度的下降先后出现应激反应：15℃时活力减弱，10℃时身体卷曲、侧翻、断螯，6℃时侧翻、僵硬。强化急降组也依次出现应激反应：14℃时活力减弱，10℃时身体卷曲、侧翻，6℃时断螯、僵硬。强化缓降组依次出现应激反应：14℃时出现活力减弱，10℃时断螯，7℃时侧翻（图3）。

图3 水温从25℃下降至6℃过程中红螯螯虾出现的应激行为Fig.3 Stress behavior of red claw crayfish Cherax quadricarinatus exposed to the water temperature change from 25℃to 6℃

2.3 低温应激对红螯螯虾活力的影响及应激反应

正常饲料投喂下水温低于16℃时，开始出现活力减弱、不活动等应激反应。正常虾状态为池底静伏或趴行，身体舒展，活动力较强，光敏感性较强，抱卵虾尾扇卷曲保护受精卵（图4-a）。正常虾受到外界刺激时，螯足呈攻击状抵御，或腹部快速且连续卷曲，向后弹跳躲避，瞳孔有反光（图4-e、h、i）。水温低于10℃出现断螯、卷曲、侧翻现象（图4-c、d）；水温低于7℃出现僵硬、昏迷状态，直至死亡。当发生侧翻时，腹部收缩、尾扇卷曲，身体的平衡性较差，敏感性较弱。身体和螯足有僵化趋势，部分个体螯足脱落，步足和游泳足不时摆动以恢复平衡状态，对外界刺激有反应，瞳孔有反光（图4-b、f、g）。随水温进一步降低，虾僵硬，即侧翻或趴卧在水底，身体和螯足僵硬，部分个体螯足脱落，步足伸展状，无光敏感性，无活动能力，受到外界刺激没有反应，瞳孔有反光（图4-c、j）。死亡时，身体的头胸甲和腹部连接处脱离、水肿（图4-k），躺平状、侧翻、趴卧水底，身体和螯足呈瘫软状态，瞳孔无反光（图4-l）。

图4 红螯螯虾在低温胁迫下的应激反应行为Fig.4 Stress response of red claw crayfish Cherax quadricarinatus under low temperature stress

2.4 不同降温方式和配合饲料对红螯螯虾影响

急降组（CJ+GJ）死亡率为（71.67±13.27）%，缓降组（CH+GH）死亡率为（60.83±14.86）%，急降组死亡率略高于缓降组；常规组（CJ+CH）死亡率为（95.83±2.71）%，强化组（GJ+GH）死亡率为（36.67±7.15）%，强化组死亡率显著小于常规组（P<0.05）（图5）。强化组出现少量进食和不进食分别为中温应激恒温阶段和低温应激期调温阶段，而常规组出现少量进食和不进食分别为中温应激调温阶段和低温应激调温阶段，强化组在进食上的应激反应延迟于常规组。

图5 水温从25℃下降至6℃全过程中不同实验组红螯螯虾死亡率Fig.5 Mortality rof red claw crayfish Cherax quadricarinatus in different experimental groups during the water temperature change from 25℃to 6℃

3 讨论

3.1 低温应激中红螯螯虾的行为变化

作为温热带经济虾种，在广大亚热带地区养殖推广中遇到的难题主要来自于低温胁迫。目前，红螯螯虾的低温应激行为研究较少，本实验观察到水温6℃时大规模死亡，推断：6℃为红螯螯虾临界致死低温。

本实验观察了红螯螯虾成虾低温应激反应，低于最适温度后，该虾没有随即出现低温应激反应，18℃时少量进食，15℃～16℃时不进食；当水温低于16℃时才开始活力减弱。水温低于9℃出现明显的低温应激反应行为。这说明就该虾在适应小幅度低温胁迫下，会通过自身调节机能，维持外在行为的相对稳定。当温度变化幅度及持续时间达到一定值时，才会表现出明显的应激反应。因此，生产中出现低温天气，要及时采取相应措施，不能等到行为出现异常后再采取挽救措施。

3.2 抗低温饲料有效性分析

了解低温胁迫对红螯螯虾应激行为，找到提高其对低温耐受力的方法，这是实现可持续发展必须解决的实际问题之一。红螯螯虾低温驯化中可能导致其氧化应激、免疫受损，最终影响其生长和存活[16]，因此，体质增强可一定程度减弱低温应激反应。不同研究表明，研制虾类冬季饲料时，适当的提高能量、并添加增加免疫力的微量元素有益于抵抗低温胁迫。针对虾蟹类抗低温饲料研究，Chien 等[17]发现，在饲料中添加80 mg/kg 的虾青素提高了斑节对虾（Penaeus monodo）抗冷应激能力，使恢复率从24%提高到73%。用不同能量蛋白比饲料投喂凡纳滨对虾，发现当温度下降时，投喂高蛋白加中能或中蛋白加高能的饲料均能有效保证凡纳滨对虾的生长[18]。本研究通过改善饲料质量提高了红螯螯虾低温胁迫的耐受性，强化组死亡率显著小于常规组（P<0.05）（图5）。常规组（常规急降组、常规缓降组）在体制增强期（30 d）内均投喂常规饲料，而强化组（强化急降组、强化缓降组）在体制增强期内均投喂抗低温饲料；常规急降组与强化急降组之间及常规缓降组与强化缓降组之间均只有摄食饲料之间有差异，其他条件相同，说明本研究中的抗低温饲料对红螯螯虾抗低温有一定的效果。

3.3 抗低温的建议措施

目前亚热带地区寒潮经常导致红螯螯虾养殖业损失惨重，本论文提出如下抗低温的建议措施：（1）关注天气变化，入秋后关注寒潮灾害性天气预报，提前上市，减少损失；（2）加强管理，短期小幅度降温，即水温不低于18℃，保障池塘或育苗池内溶氧大于5 mg/L，硫化氢、亚硝酸氮、氨氮含量不超标，水质良好，适当减少饲料投喂，避免引发群体死亡；（3）进入秋季，暂时没有上市计划的红螯螯虾可投喂抗低温饲料，增强虾体质，寒潮来临时可延缓虾体出现的低温应激反应，争取上市时间。