拟南芥CARK5激酶响应脱落酸信号的研究

李柯萱 李小意 王若琳 杨毅

为了研究拟南芥脱落酸（Abscisic acid，ABA）受体的翻译后修饰，本研究以能够磷酸化ABA受体的激酶CARK5作为研究对象，通过构建了转基因株系来检测CARK5在ABA信号途径中的功能.结果显示： CARK5能够促进ABA介导的抑制种子萌发、幼苗的形态建成以及主根的生长，但是过表达激酶失活型CARK5m（CARK5N250A）则跟突变体cark5表型类似.拟南芥中过表达CARK5增强植株抗旱性；ABA处理后，ABA响应标记基因RAB18表达量增加.这些结果说明，CARK5通过可以磷酸化ABA受体，正调控ABA信号通路.

CARK5； 磷酸化； 脱落酸； 干旱胁迫

Q495A2023.036001

收稿日期： 2022-05-26

基金项目： 四川省国家自然科学基金（2022NSFSC0162）

作者简介： 李柯萱（1997-）， 女， 四川自贡人， 硕士研究生， 研究方向为植物遗传学. E-mail： likexuan1312@163.com

通讯作者： 杨毅. E-mail： yangyi528@scu.edu.cn

Response of CARK5 kinase to ABA signaling in Arabidopsis

LI Ke-Xuan， LI Xiao-Yi， WANG Ruo-Lin， YANG Yi

（Key Laboratory of Bio-Resources and Eco-Environment of Ministry of Education，  College of Life Sciences， Sichuan University， Chengdu 610065， China）

In order to explore the post-translational modification of Arabidopsis abscisic acid （ABA） receptor， this study constructed overexpressing CARK5 and kinase-dead CARK5m （CARK5N250A） in the wild type and T-DNA mutant cark5 plants by genetic and physiological assays， to analyze the functions of CARK5 in ABA signaling. The results showed that CARK5 can promote ABA-mediated inhibition of seed germination， seedling cotyledon and primary root elongation， but the overexpression kinase-inactive CARK5m （CARK5N250A） has a similar phenotype to the mutant cark5. In addition， overexpressing CARK5 enhanced plant drought resistance and ABA-marked gene RAB18 expression. Taken together， these data suggest that CARK5 positively regulates the ABA signaling pathway by phosphorylation of ABA receptors.

CARK5； Phosphorylation； Abscisic acid； Drought stress

1 引 言

植物能够通过捕捉环境信号，然后激活植物激素介导的多种内源途径，进而影响植物从种子成熟、种子萌发到开花结果以及响应生物或者非生物胁迫等各种生命活动［1，2］.其中脱落酸（Abscisicacid，ABA）是一种由类胡萝卜素裂解而成的重要植物激素［3］，在植物中具有多种生理功能.ABA通过调控种子的休眠和萌发以及气孔的开度等生理活动，来应对干旱、高温、高盐等环境胁迫［4］.拟南芥响应ABA信号通路的过程是：首先ABA受体PYR1/PYLs/RCARs（Regulatory Components of ABA Receptors/Pyrabactin Resistance/PYR like）感知ABA后，能够抑制磷酸酶PP2C活性，激活激酶SnRK2s，使其磷酸化ABA信号通路的下游信号分子，最终响应ABA信号.ABA受体作为ABA信号通路中的核心成员［5-7］，在拟南芥中总共有14个成员［8］.在14个成员中除了PYL13以外，其余13个都被证实能够结合ABA.

自从ABA受体被发现以来，研究者也一直在研究其翻译后修饰，其中ABA受体的磷酸化修饰在ABA信号转导中具有重要作用［9］.本实验室前期研究筛选出能够结合并使部分RCARs磷酸化的ABA受体激酶（Cytosolic  ABA Receptor  Kinase，CARK），该家族一共有11个成员，它们的激活环中都具有保守的天冬氨酰（N）.其中CARK1属于拟南芥丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶RLCKⅧ亚家族，研究发现CARK1能够通过结合并磷酸化RCAR3和RCAR11-14从而抑制PP2C活性，促进ABA信号通路［10，11］.除此之外，CARK3以ABA依赖的方式转录干扰果胶甲酯酶抑制物（PMEL）的转录，进而调节拟南芥的花粉育性［12］.最近的研究也表明，CARK2、CARK4、CARK5、CARK7和CARK11磷酸化二聚化受体后，从而解聚，增强ABA结合能力［13］.由于CARKs在植物的生长发育以及抗逆性中的作用既存在冗余又可能有差异，所以有必要对每个成员在ABA信号途径中的功能进行分析.因此，本研究选取能够与RCARs相互作用的CARK5进行分析，探究其响应ABA信号的表型和ABA下游基因的转录水平.

2 材料与方法

2.1 材 料

T-DNA插入突变的拟南芥种子cark5（SALK_136404）购买自网站拟南芥生物资源中心ABRC（http：//www.arabidopsis.org/）.野生型拟南芥（Arabidopsis thalian）为哥伦比亚野生型（Col-0）.拟南芥先播种在MS固体培养基（MS粉末加上2%蔗糖和0.8%的琼脂粉）上培养5～7 d，等到开始长出真叶时再移栽到配置的营养土（蛭石∶营养土=1∶3混匀，并进行121 ℃高压灭菌20 min后冷却至室温）.

2.2 实验方法

2.2.1 拟南芥过表达和回补株系构建 将目的基因构建到pBI121载体中，回补株系用pZH01载体.构建成功的载体转化至大肠杆菌DH5α，进行菌落PCR和测序检测，确定构建成功后将DH5α进行扩大培养并提取质粒转入农杆菌GV3101中.采用花絮侵染法［14］得到带有卡那抗性（回补株系为利福平抗性）的T0代种子，再利用含抗性的MS平板进行筛选出能够长出真叶的阳性株系，然后在土壤中培养传代，利用孟德尔遗传定律检验得到T2代株系.T2代种子再播种于相应抗性的MS平板上，验证纯合株系.T3代种子用于表现分析.

2.2.2 实时荧光定量PCR（qRT-PCR） 将待测组织用液氮速冻后研磨，每50～100 mg组织用1 mL Trizol试剂对组织进行裂解，加入氯仿后在冰上沉淀10 min，使核蛋白复合物解离，再用异丙醇沉淀回收总 RNA.得到的总RNA后根据Takara反转录试剂盒说明书将RNA反转成cDNA，最后根据Takara荧光定量PCR酶使用说明书配制qRT-PCR反应体系，体系及程序如表1所示，同时保证每个样本技术重复三次，生物学重复三次.

2.2.3 ABA处理下种子萌发率统计 将每个株系约100颗种子春化3 d后消毒播种于含终浓度分别为0、0.3、1.0、3.0和10.0 μmol/L ABA的MS培养基中，置于温室中培养，持续1 w，每天数萌发率.萌发率=萌发的种子数/种子的总数.

2.2.4 ABA处理下幼苗形态建成实验分析 每个株系播种约50颗种子于终浓度为0和0.3  μmol/L ABA的MS平板上，7 d后观察它们子叶变绿情况，计算子叶变绿的比率.

2.2.5 ABA处理下根长实验分析 每个株系拟南芥种子播种于MS平板，竖置生长2～3 d后选择长度长势相似的植株移植到1/2MS平板中，且加入30 μmol/L ABA.观察它们主根伸长情况，7～8 d后拍照用imageJ软件测量主根长度.

2.2.6 幼苗干旱及复水处理 将拟南芥种子春化后直接播种到土里，每个株系至少3盆，每两天浇一次水，保证植物正常生长，生长两周后，停止浇水，干旱13 d后拍照记录，再进行复水处理，连续浇水直到土壤吸水饱和，两天后观察植株存活率.

3 结 果

3.1 qRT-PCR鉴定CARK5转基因株系

前期已经从购买的种子中鉴定出cark5突变株系，然后构建并筛选出了CARK5过表达株系OE-CARK5 #5和OE-CARK5 #31，并进行了qRT-PCR实验进行验证.qRT-PCR结果显示cark5突变株系的CARK5基因表达水平几乎未检测到，说明该突变体为敲除突变体，用于后续分析；两种过表达株系的CARK5表达量相比野生型都增加5倍以上（图 1）.另外为了更好地验证CARK5基因的功能，本实验还构建了cark5突变株的背景下回补CARK5激酶位点突变的株系com-CARK5m #1和com-CARK5m #9，如qRT-PCR结果所示，CARK5 mRNA转录水平相对于野生型也有显著提高（图 1）.

3.2 ABA对CARK5转基因株系种子萌发和幼苗形态建成的影响

因为已有的研究表明CARK5能够与ABA受体相互作用，所以本研究想探讨它在拟南芥中是否调控ABA介导的种子萌发和幼苗形态建成等生物学功能.首先进行了种子萌发实验，结果显示：不添加外源ABA的情况下，以及0.3 μmol/L低浓度ABA处理时，CARK5转基因株系种子的萌发率都没有明显区别； 1.0 μmol/L ABA时，WT、cark5、OE-CARK5 #5、OE-CARK5 #31、com-CARK5m #1和com-CARK5m #9的萌发率分别为：40%、75%、35%、40%、54%和60%；当ABA浓度升高到3 μmol/L时，OE-CARK5 #5和OE-CARK5 #31种子几乎不萌发，而cark5、com-CARK5m #1和com-CARK5m #9没有显著差异.因此，拟南芥中CARK5缺失之后，与野生型相比，对ABA的敏感程度降低，而过表达CARK5会增加植株对ABA的敏感程度.并且回补CARK5激酶活性位点突变的CARK5m到cark5株系后，com-CARK5m #1和com-CARK5m #9株系萌发率显著高于野生型，而与cark5没有显著差异，都表现出对ABA不敏感（图2a）.

虽然在0.3 μmol/L ABA处理下，CARK5转基因植株的种子萌发率没有明显区别（图2a），但是继续培养10天后， WT、cark5、OE-CARK5 #5、OE-CARK5 #31、com-CARK5m #1和com-CARK5m #9的子叶绿化率比率分别为：8%、100%、20%、12%、94%和95%.com-CARK5m与cark5相似且都表现为ABA的不敏感，幼苗子叶变绿程度极高.而过表达株系与野生型都表现出了ABA抑制子叶变绿（图2b）.综上结果表明CARK5在ABA介导的抑制种子萌发和子叶变绿中起正调控作用.

3.3 CARK5在ABA处理下对根长伸长的影响

对CARK5转基因株系在ABA介导下根伸长情况进行实验分析.将MS培养基培养3 d的幼苗转移到不含ABA和含30 μmol/L ABA的1/2MS培养基中，继续培养7 d后，结果如图 3所示，在正常情况下，各株系的根长几乎一致；而ABA处理之后，WT、cark5、OE-CARK5 #5、OE-CARK5 #31、com-CARK5m #1和com-CARK5m #9跟对照组的比较，根长分别抑制了45.8%、55.1%、31.7%、29.1%、67.4%和47.1%.过表达株系较于野生型株系对ABA敏感，突变体的主根伸长对ABA处理较不敏感，而回补激酶失活型CARK5，不能回补到野生型的表型.这些结果说明CARK5同样依赖其激酶活性来影响ABA对根长的抑制作用.

3.4 CARK5转基因株系对干旱胁迫的响应

对2周大小的WT、cark5、OE- CARK5 #5、OE-CARK5 #31、com-CARK5m#1和com-CARK5m #9幼苗进行13 d的干旱处理，结果发现：干旱13 d的时候，WT、cark5和com-CARK5m #1和com-CARK5m #9就已经萎蔫了；相对而言，OE-CARK5 #5和OE-CARK5 #31脱水程度更低.复水2 d后发现，WT大部分幼苗恢复；而cark5、com-CARK5m #1和com-CARK5m #9的所有植株都因为脱水致死；而OE-CARK5的两个株系都全部恢复.如图所示（图4），所有株系在干旱处理前的长势是一致的，因此可以得出OE-CARK5最耐旱，从而可以推断CARK5在植物应对干旱胁迫中起正调控作用.

3.5 ABA处理CARK5转基因株系后调控下游基因的转录水平

CARK5与ABA受体能够相互作用，因此本研究检测了ABA信号通路中的标记基因RAB18来判断它是否会响应ABA信号通路.用50 μmol/L ABA处理10 d大小的WT、cark5、com-CARK5m #1、com-CARK5m #9、OE-CARK 5 #31.3 h后收样，提取RNA，然后做qRT-PCR，检测ABA信号响应标记基因RAB18的相对表达量.如结果所示（图5），ABA处理后RAB18的表达量相对于处理前都有显著升高，其中在OE-CARK5#31中的表达量最高，在WT中次之，在cark5、com-CARK5m #1和com-CARK5m #9株系中最低，并且处理后它们都与野生型存在显著性差异.因此，CARK5能促进ABA下游响应基因的表达，相反，CARK5m不能激活ABA信号通路.

4 讨 论

ABA受体的磷酸化是一种由不同的激酶引起的翻译后修饰.例如，TOR磷酸化ABA受体PYL4（RCAR10），终止ABA信号来平衡植物的生长和抗逆性［15］.AEL酪蛋白激酶通过磷酸化136和182的丝氨酸来破坏ABA受体PYL1（RCAR12）的稳定性，进而抑制植物对ABA的响应，导致拟南芥应对干旱胁迫的能力减弱［16］.而本实验室前期研究已经发现，CARK1磷酸化RCAR3、RCAR11抑制了PP2C活性，正向调节ABA信号，所以过表达CARK1能够显著提高拟南芥的抗旱性［11］. 已有研究表明CARKs偏好于与ABA受体亚家族III的成员相互作用，在ABA信号转导中起冗余作用.有趣的是，CARK1、CARK4和CARK5与RCAR3相互作用，而CARK2、CARK7和CARK11不能［13］.这种差异可能是因为CARK基因是从共同的祖先基因复制而来的，并且在植物多样化的过程中发生功能分化［17］. 例如，蛋白激酶AEL磷酸化ABA受体，从而降低其稳定性，抑制ABA信号通路.说明不同的激酶与ABA受体存在相互作用，并且能够磷酸化ABA受体家族不同的基因以及不同的位点，发生不同的ABA响应.CARK5与ABA受体RCAR3、RCAR11、RCAR12、RCAR13和RCAR14有相互作用，并且能磷酸化RCAR11、RCAR12、RCAR13和RCAR14［13］.但是CARK5在植物生长发育中具体表型还不明确，所以本研究在CARK5已有的分子研究基础上，构建CARK5相关转基因株系，进一步探讨CARK5对幼苗响应ABA在种子萌发和形态建成上的影响、成苗响应干旱的影响以及对下游基因表达的影响.

对CARK5的转基因株系的功能进行分析表明：CARK5能抑制种子的萌发、幼苗的形态建成以及主根的生长.磷酸激酶活性位点突变的com-CARK5m株系虽然mRNA的表达量仍然较高，但是却影响了CARK5的功能，再次说明CARK5通过磷酸化ABA受体来发挥作用，进而影响拟南芥生长发育.那么CARK5是如何与特定的ABA受体作用的呢？前面提到CARK5和CARK1一样都能够与RCAR3相互作用，已有研究表明CARK1磷酸化ABA受体后，改变了它们的结构，可能使它们更容易与ABA结合，特别是单体的状态的RCARs，例如RCAR3;同时也可能导致本来是同源二聚体态的RCARs成为单体，从而暴露了结合PP2Cs的loop［18］，所以CARK5很可能与CARK1有同样的作用机制，是否存在差异还需要进一步研究.

为了研究CARK5在非生物胁迫中的功能，对CARK5相关转基因株系进行干旱处理，结果表明它们在调节干旱胁迫中起正调控的作用.并且过表达CARK5能够使ABA诱导表达的下游标记基因RAB18显著升高，说明CARK5磷酸化ABA受体后，提高RAB18转录水平，从而促进ABA信号通路，进而提高植物耐旱性.但CARK5是如何受ABA调控来影响ABA受体RCARs的磷酸化还需要继续研究.因此需要进一步研究ABA是否诱导了CARKs的表达，使RCARs被磷酸化的比例增加或者结构改变，从而促进ABA信号通路，或者是RCARs被磷酸化后，进一步引起ABA信号通路中其它蛋白结构的改变进而影响ABA响应，所以还需要进行更多实验来进行验证.CARK5在ABA信号途径中功能的分析，有助于理解植物抗逆机理.

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引用本文格式：

中 文：  李柯萱， 李小意， 王若琳， 等. 拟南芥CARK5激酶响应脱落酸信号的研究［J］. 四川大学学报：  自然科学版， 2023， 60：  036001.

英 文：  Li K X， Li X Y， Wang R L， et al. Response of CARK5 kinase to ABA signaling in Arabidopsis ［J］. J Sichuan Univ：  Nat Sci Ed， 2023， 60：  036001.