5-氟-胞苷抗肿瘤活性及其机制研究

王绍昕 秦童 黄震

摘要：为进一步探求高效、广谱的抗肿瘤氟代化学修饰小分子药物，为癌症治疗提出新的解决方案，本研究通过分子对接技术和细胞活性、流式细胞、转录组分析、DNA损伤等实验来探索氟修饰核苷类分子5-氟胞苷的抗肿瘤活性及其作用机制.实验结果表明，5-氟胞苷在多种肿瘤细胞中的 IC  50  小于 1 μmol/L，且5-F-Cyd较为明显地调节了癌症的发生与发展机制，与影响DNA复制、造成DNA损伤和诱导细胞凋亡有关.此外，还发现氟原子修饰的5-氟胞苷有可能通过干扰聚合酶 θ的修复功能来阻止耐药的发生. 因此，5-氟胞苷可作为癌症治疗的潜在候选药物.

关键词：核苷类药物； 抗肿瘤； 凋亡； DNA损伤

中图分类号：  Q291

文献标识码：A

DOI：10.19907/j.0490-6756.2023.056002

收稿日期： 2023-04-13

基金项目：  西南特色中药资源国家重点实验室开放基金（SKLTCM202202， 2022/09-2023/08）

作者简介：   王绍昕（1998-）， 女，  山东临沂人， 硕士研究生， 研究方向为细胞生物学. E-mail： 1250688706@qq.com

通讯作者：  黄震.zhen_huang@scu.edu.cn

The antitumor activity and mechanism of 5-fluoro-cytidine

WANG Shao-Xin， QIN Tong， HUANG Zhen

（Key Laboratory of Bio-Resources and Eco-Environment of Ministry of Educaion， College of Life Sciences， Sichuan University， Chengdu 610065， China）

To further explore efficient and broad-spectrum anti-tumor fluorinated chemically modified small molecule drugs and propose new solutions for cancer therapy， this study explored the antitumor activity and mechanism of fluorine-modified nucleoside analog molecule 5-fluorocytidine by molecular docking technique and cell activity， flow cytometry， transcriptome analysis， DNA damage. The experimental results showed that the IC  50  of 5-fluorocytidine in a variety of tumor cells is less than 1 μmol/L. Moreover， 5-F-Cyd significantly regulates the occurrence and development of cancer， affecting DNA replication， causing DNA damage， and inducing cell apoptosis. In addition， it was found that fluorine-atom-modified 5-fluoro-cytidine has the potential to prevent the development of drug resistance by interfering with the repair function of polymerase θ. In conclusion， 5-fluorocytidine may serve as a potential drug candidate for cancer therapy.

Nucleoside analogs; Antitumor; Apoptosis；DNA damage

1 引 言

作為世界上第二大致死病因，癌症的患病率和病死率逐年升高  ［1］ .根据世界卫生组织国际癌症研究机构（International Agency for Research on Cancer，IARC）公布的数据，中国以457万病例位居2020年癌症新发人数的国家榜首，美国和印度分别以228万和132万居第二和第三位  ［2］ .短短六年时间，中国新发癌症病例就从2016年的406.4万例，增至2022年的482万例，增幅高达18.6%  ［3］ .在目前我们已知的癌症中，胰腺癌因其诊断、治疗难度高及低生存率被称为“癌症之王”.随着对癌症发病机制探索与完善，各种肿瘤的治疗得到了长足的发展，但胰腺癌的诊断与治疗在近年来几乎没有变化  ［4］ .因此，本研究计划以胰腺癌细胞株（PANC-1）进行主要的机制探索，为胰腺癌治疗提供新思路.

化疗是目前癌症治疗最常见和最有效的主要方法之一  ［5］ .根据美国疾病控制与预防中心（Centers for Disease Control and Prevention，CDC）的数据，美国每年约有65万名癌症患者在门诊癌症治疗中接受化疗.根据作用机制不同，抗癌化疗药物分为以下六种：a）造成DNA损伤的烷基化剂；b） 掺入DNA或RNA合成链中，引起链合成中断的链终止剂；c）聚合酶或与核苷酸合成相关酶的活性抑制剂；d）拓扑异构酶I或II的抑制剂；e）有丝分裂和细胞分裂的抑制剂；f）治疗癌症和减轻其他药物副作用的皮质类固醇  ［6］ .其中，核苷类小分子的主要机制是作为核苷酸合成相关酶的活性抑制剂，干扰核苷酸的合成；作为DNA或RNA合成的底物，或作为聚合酶抑制剂与聚合酶紧密结合，干扰其正常功能的行使，从而引起新生DNA或RNA链合成的终止  ［7］ .随着新冠病毒爆发，人们又开始关注核苷类药物的抗病毒机理.核苷的修饰可引起其结构、稳定性和选择性变化，从而具有抗病毒或抗癌的效力  ［8］ .需要指出的是，从核苷的结构来看，抗病毒和抗肿瘤并没有绝对严格的区分  ［9］ .氟原子修饰的核苷类药物，由于可以提高药物选择性、有效性及递送效率等优势，已成为主要的修饰策略之一.此外，该类药物还具有易于合成、储存、运输和标准化等优点  ［10］ .氟代药物已经被用于癌症、艾滋病毒、疟疾和天花感染在内的多种疾病治疗  ［11］ ，5-氟胞苷（5-F-Cyd）作为一种氟代核苷类药物，在临床上被广泛应用于酵母和真菌感染的治疗，其基本机制为先脱氨，转变成为5-氟尿苷，然后代谢为其它尿苷类似物，并且少量被转化为5-氟胞苷三磷酸，随后被掺入RNA合成链，进而终止RNA合成  ［12］ .有研究表明，氟胞苷和氟脱氧胞苷对的人宫颈癌细胞株的生长具有较强抑制作用  ［13］ .因此，我们计划对其抗肿瘤机制进行进一步的研究，以便进一步探求高效、广谱的抗肿瘤氟代化学修饰小分子药物，为癌症治疗提出新的广谱解决方案.

2 材料和方法

2.1 实验材料

PANC-1细胞、LNCaP细胞、MCF-7细胞、PC-3细胞购自中科院上海细胞所；细胞培养皿、96孔板、离心管购自Corning公司（中国）；DMEM培养基、PBS缓冲液、胰酶购自Hyclone公司（美国）；澳洲胎牛血清购自Thermo fisher公司（美国）；DMSO、 Cell Counting Kit-8试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司.

2.2 实验方法

2.2.1 小分子核苷药物的细胞活性实验  取对数期生长的PANC-1细胞，胰酶消化后离心，弃上清，含有10% FBS的DMEM培养基重悬后计数，根据计数结果96孔板铺板.每孔约3500个细胞（具体数目根据预实验确定），各实验组、阴性对照组和阳性对照组设5个复孔，1个空白组作为背景.37 ℃培养箱过夜培养贴壁，细胞融合度为 30%～40% 时药物处理，按浓度梯度（1 nmol/L、 10 nmol/L 、100 nmol/L、1 μmol/L和10 μmol/L浓度）给药，继续培养48 h后，CCK8处理后测定吸光度.

2.2.2 5-F-Cyd的流式细胞实验  使用10 μmol/L  的5-F-Cyd，以及吉西他滨处理PANC-1细胞48 h ，阴性对照组使用PBS处理.经Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒处理染色后，上机检测.

2.2.3 转录组测序  PANC-1细胞与10 μmol/L浓度的5-F-Cyd以及未经处理的阴性对照组（NC）共同孵育48 h后，用Trizol试剂将细胞从培养板吹打至2 mL离心管，存于-80 ℃或直接送检.

2.2.4 DNA损伤实验  用96孔板铺板，每孔1×10  4 个PANC-1细胞，过夜贴壁给药4～7 h（ 50 μmol/L 、 30 μmol/L、20 μmol/L Capecitabine， Cisplatin， B0， B2）. 使用DNA损伤试剂盒处理后，用荧光显微镜观察并拍照.

2.2.5 分子对接  在PDB下载蛋白质结构，使用autodock tools预处理小分子结构和蛋白质结构，并设定grid，使用autodock vina进行虚拟对接以及用pymol分析结果.

3 结果与分析

3.1 5-氟-胞苷对癌细胞增殖的作用

使用经化学合成的5-氟-胞嘧啶（5-F-Cytosine，5-F-Cyt）和5-氟-胞苷（5-F-Cytidine，5-F-Cyd）在胰腺癌细胞PANC-1，乳腺癌细胞MCF-7，前列腺癌细胞LNcap和PC-3等多种癌细胞系中进行细胞增殖实验，化合物结构如图1所示.细胞活性实验使用吉西他滨（Gemcitabine，Gem）作为对照，设置五个药物浓度，经不同化合物处理48 h的细胞，使用CCK8检测细胞增殖速率（图2）.实验结果表明，在多种癌细胞系中，5-F-Cyd均显示出良好的细胞增殖抑制效果，且5-F-Cyd的活性优于广谱化疗药物吉西他滨.此外，5-F-Cyd在PANC-1、MCF-7、LNcaP细胞系中的IC  50 分别为0.19 μmol/L、0.85 μmol/L和0.60 μmol/L，展现出显著抑制肿瘤细胞增殖的活性.

3.2  5-氟-胞苷处理后的转录组测序结果分析

对其处理的PANC-1细胞进行了转录组测 序，并对差异基因进行KEGG聚类分析，选取显著性最高的20个基因绘制不同通路的基因表达差异图（图3）.5-F-Cyd处理后，DNA复制、DNA损伤与修复、细胞周期、细胞凋亡以及与癌症相关的多条通路均有上调，显示5-F-Cyd较为明显的调节了癌症的发生与发展，且机制与影响DNA复制、造成DNA损伤和诱导细胞凋亡有关；同时，有机物的代谢以及胞质、细胞器代谢、蛋白质结合等通路发生了下调，说明5-F-Cyd影响或阻碍了细胞的正常代谢过程.

3.3 5-氟-胞苷的DNA损伤

基于转录组测序中，5-F-Cyd处理后关于DNA损伤和修复途径差异表达的结果，为验证其是否会造成DNA损伤，本研究用磷酸化H2AX （γ-H2AX）作为损伤标志物来检测DNA损伤情况（DNA双链断裂）.DNA双链断裂损伤（DNA double strand break damage ，DSB）是最危险的DNA损伤类型之一.哺乳动物细胞中对DSB的首批反应之一是组蛋白变体H2AX的Ser139残基的磷酸化，H2AX的Ser139残基的磷酸化导致染色质凝结，并在修复因子的招募中发挥重要作用，由于H2AX在Ser139位点的磷酸化与DSB具良好相关性，因此磷酸化H2AX（γ-H2AX）是检测DNA损伤及其修复的敏感标记物.结果显示，5-F-Cyd处理后的细胞产生了强烈DNA损伤荧光，说明与转录组测序结果一致，5-F-Cyd确可引起DNA损伤.

3.4 5-氟-胞苷的三磷酸形式与pol θ的虚拟对接

DNA损伤实验表明，5-F-Cyd可引起DNA双链断裂损伤，该损伤可通过DNA聚合酶theta（pol θ）介导的末端连接（TMEJ）进行修复.有研究表明，抑制TMEJ的药物在组合治疗策略中非常有效  ［14］ .

为探究5-F-Cyd造成DNA损伤的分子机理，本研究用分子对接的方式探究氟修饰核苷对于pol θ的亲和力影响.结果显示（图5），5-F-Cyd的三磷酸形式与pol θ 的 Kd 值为5.94×10  -7  mol/L， 相对于其天然底物dCTP的 Kd 值（1.40×10  -5  mol/L）下降了两个数量级，即亲和力更高.此外，氟修饰还改变了核苷酸的结合位点及其与聚合酶的相互作用力，相比dCTP只与pol θ通过氢键连接，5-F-CTP与pol θ的相互作用力更多且出现了盐键的连接（图6）.这些结果表明氟修饰会大大提升核苷与pol θ的亲和力，改变核苷酸与pol θ的相互作用力，因此pol θ可能是5-F-Cyd，乃至氟代核苷药物的潜在靶点.

3.5 5-氟-胞苷可显著促进癌细胞凋亡

基于5-F-Cyd在PANC-1细胞系中显著抗癌效果，以及引起DNA损伤的结果，推测其抗癌机制之一可能是通过造成DNA损伤，进而促进肿瘤细胞凋亡，杀死肿瘤细胞.本实验以吉西他滨为阳性对照，通过流式细胞术实验探究5-F-Cyd的促凋亡活性.结果表明（图7），经药物处理48 h后：吉西他滨组（Gem）与文献报道一致，引起14.1%的细胞凋亡  ［15］ ，其中13.0%细胞处于凋亡晚期阶段，1.1%细胞处于早凋阶段；5-F-Cyd引起70.4%的细胞凋亡，其中68.8%和1.6%的细胞分别处于晚凋和早凋阶段.与吉西他滨相比，5-F-Cyd引起更为显著的凋亡现象.

4 讨 论

众多研究表明，DNA损伤剂以及DNA合成抑制剂，常通过造成DNA损伤，进而触发细胞凋亡来诱导肿瘤细胞死亡  ［16，17］ ，我们也得出了一致的结论.本研究探索了在多种癌细胞系中具有良好抗癌活性的氟代核苷类似物5-氟-胞苷.我们发现其在多种细胞系中的活性均优于广谱化疗药物吉西他滨，此外5-氟-胞苷在胰腺癌细胞系PANC-1中的效果较为显著.众所周知，胰腺癌作为生存率最低常见癌症，因发病位置特殊和发展速度极快，其诊断和治疗都存在极大的困难  ［18］ .胰腺癌是一种侵袭性癌症，在西方国家中是恶性肿瘤相关死亡的第四大原因  ［19］ .美国癌症协会估计，每年大约有4.4万人死于胰腺癌  ［20］ .本研究以胰腺癌细胞系（PANC-1）为模型探索核苷类药物的活性和机制，对于胰腺癌的治疗具有一定借鉴意义.

为探索5-氟-胞苷的细胞生物学机制，本研究进行了转录组测序分析.结果显示，经5-F-Cyd处理后，PANC-1细胞系中与癌症发生发展、DNA复制、细胞周期、DNA损伤修复等相关的通路发生明显上调.DNA损伤实验和流式细胞术进一步验证了转录组测序结果，5-F-Cyd通过引起DNA损伤，进而促进肿瘤细胞凋亡.此外，本研究借助分子虚拟对接技术，发现5-F-Cyd的三磷酸形式与pol θ的结合位点和相互作用力与天然底物（脱氧胞嘧啶核苷三磷酸）不同，除氢键外还通过盐键与pol θ作用，且结合力更强.因此，5-氟-胞苷很可能以pol θ为靶点，通过阻止其修复双链断裂损伤，防止耐药的发生，强化抗肿瘤效果.pol θ是负责损伤修复的关键酶之一.抗肿瘤药物能引起DNA损伤，然而DNA损伤可以通过DNA损伤反应（DDR）  ［21］  逆转，从而对药物产生耐药性，这个过程中存在多种DNA聚合酶的参与  ［22］ .因此，DNA聚合酶是重要的药物耐药性研究靶点，值得进一步的研究与探索.

综上所述，5-氟-胞苷具有显著的抑制多种肿瘤细胞增殖和促进胰腺癌细胞凋亡的效果，且很可能通过干扰pol θ 的修复功能，阻止耐药反应的发生，这些结果为在后续研究中将其用于胰腺癌治疗或探究核苷类药物的耐药机制提供了可能.然而，一些核苷类药物表现出的临床毒性，限制了它们的使用  ［23］ ，现多采取化学修饰将高活性分子改造为药物前体的方式  ［24］ ，降低核苷类药物的毒性.因此后续工作也将对5-F-Cyd的毒副作用进行研究，并尝试通过合理的修饰改造方法，降低毒副作用的同时，保留其高抗肿瘤活性.总之，本文对5-氟胞苷抑制癌细胞增殖活性及其作用机制进行了初步探究，其显著的抑癌活性可使其有望成为癌症治疗和新药研发改造的候选药物，值得进一步研究、探索与改造.

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